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扫描电镜技术

TechniquesofScanningElectronMicroscope扫描电镜的基本结构与成像原理扫描电镜的特点扫描电镜的生物样品制备技术样品的常规制备方法特殊样品的制备方法

扫描电镜技术扫描电镜（ScanningElectronMicroscope，SEM）是继光镜和透射电镜之后发展起来的一种电镜，用于观察物质表面及断面的三维形貌结构和进行微区成分分析。

一、扫描电镜的基本结构

与成像原理

1、SEM基本结构及其作用（１）电子光学系统电子枪：阴极、阳极、栅极。阴极—通电加热后产生电子束。阳极—加速电子束。栅极—控制和会聚电子束流。电磁透镜：会聚电子束，形成直径5~10纳米的电子束（即电子探针），照射于样品上。图1-1扫描电镜工作原理图

1在样品表面以下几纳米到几十纳米的区域，被入射电子（初级电子、一次电子）所激发出来的样品原子中的外层电子，称谓二次电子（次级电子）。2SEM通常是由二次电子所形成的图象来显示生物样品的表面形貌。二次电子的来源及作用（２）检测系统

二次电子检测系统的组成及作用组成：检测器（二次电子探头）、光电倍增管、视频放大器。作用：对二次电子进行收集、放大和处理，以调制显像管栅极电压并成象。图1-1扫描电镜工作原理图（２）检测系统

组成：扫描发生器、扫描线圈。作用：使镜筒和显像管内的电子束分别进行同步光栅状扫描，最后在显像管的荧光屏上显示出完整图象。图1-1扫描电镜工作原理图（３）电子偏转系统（扫描系统）

2、影响图象形成的因素（1）倾斜角效应——二次电子成像原理∵二次电子产率主要取决于电子束的入射角，而入射角又主要取决于样品的倾斜程度。∴样品的倾斜角效应是影响图象反差的主要因素。∴SEM图象的反差主要是由样品表面的凹凸状态决定的，越是凸出的部位产生二次电子的数量越多，图象越明亮，反之则较暗。图1-2样品倾斜对二次电子产率的影响

对策：观察生物样品时，在样品表面喷镀一层原子序数高的金属膜，可提高图象质量。原子序数效应：样品内原子序数不同的元素，在图象上也会形成一定的亮度差异，这种现象称为原子序数效应。原子序数效应2、影响图象形成的因素

2、影响图象形成的因素（3）充放电效应充电：当初级电子轰击干燥的生物样品表面时，会因其导电性能差而发生电荷积累的充电现象，并对随后到来的初级电子产生排斥，使电子散开，且导致二次电子发射轨迹偏斜或杂乱。放电：轰击区内电子堆积，与邻近区域间产生电位差，则可产生放电打火现象。充放电效应：上述充、放电状况造成图象忽明忽暗或模糊不清等现象，称为充放电效应。对策：采用金属镀膜、导电胶粘贴样品等导电处理，可减少充放电效应的影响。图1-4血细胞充放电效应图例

二、扫描电镜的特点

（一）图谱

可结合元素分析。样品制备简单。可观察块状样品：0.5~10cm3。放大范围广，分辨率较高：放大倍数为数10倍~数10万倍；分辨率取决于电子探针的直径，一般为5~10nm。图象景深大，富有立体感。观察表面形貌。（二）扫描电镜的特点

三、扫描电镜生物样品制备技术

取材→清洗→固定→清洗→脱水→干燥→金属镀膜→SEM观察（一）样品的常规制备方法

1取样部位要准确。2取样大小要适当：常为≤1cm3。4样品的基底部应切割平整（以便于样品粘贴），观察面应作好识别标记。3取样操作要轻巧快捷：取样要快，严防对样品的挤压损伤，以使样品更近于活体状态。取样

清洗2、清洗（1）清洗的目的：充分暴露样品观察面的表面特征。（2）清洗液的选择常规洗液——生理盐水、PBS等缓冲液；特殊洗液——低浓度的蛋白水解酶或乙醇等，用于表面覆盖着大量蛋白或脂类黏液的样品（如胃、肠黏膜及乳腺组织等）的初级清洗。（3）清洗的方法浸泡清洗。震荡清洗：一些粘着杂质多而紧密的样品（如胃、肠黏膜等），可利用震荡器进行震荡清洗。离心清洗：游离细胞、微生物及其它微小生物样品的清洗。（4）清洗的要求样品要清洗干净：换液数次，可在解剖镜下检查，直至干净，以充分暴露表面特征。

固定3、固定（1）固定的目的保留样品的微细结构和外部形貌，使其更近于生活状态。使组织硬化，以增强样品在随后的干燥过程中耐受表面张力变化的能力。提高样品对镜筒内高真空和电子束轰击的耐受力。（2）常用的固定剂戊二醛：常用浓度为1~4%。锇酸：一般用1~2%浓度。（3）固定的方法先用戊二醛固定1至几小时或更长，经缓冲液充分清洗后，再用锇酸固定