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辛伐他汀纳米粒对脂多糖刺激的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

摘要

本研究旨在探究辛伐他汀纳米粒对脂多糖（LPS）刺激的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡的影响及其潜在机制。通过制备辛伐他汀纳米粒，以不同浓度作用于经LPS刺激的HUVECs，运用流式细胞术、Westernblot等实验方法，检测细胞凋亡率及相关凋亡蛋白表达水平。结果表明，辛伐他汀纳米粒可显著降低LPS诱导的HUVECs凋亡率，并调节相关凋亡蛋白的表达，提示其对LPS刺激的HUVECs具有保护作用，为进一步揭示辛伐他汀纳米粒在炎症相关血管内皮损伤中的作用机制提供理论依据。

关键词

辛伐他汀纳米粒；脂多糖；人脐静脉内皮细胞；细胞凋亡

一、引言

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为血管内皮的重要组成部分，在维持血管稳态、调节炎症反应以及物质交换等生理过程中发挥着关键作用。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，当机体受到细菌感染或处于炎症状态时，LPS可大量释放入血，与血管内皮细胞表面的受体结合，引发一系列炎症反应，导致内皮细胞功能紊乱甚至凋亡，进而破坏血管内皮屏障完整性，参与多种心血管疾病及炎症相关疾病的病理进程。

辛伐他汀是一种广泛应用的他汀类降脂药物，除了调节血脂外，还具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种多效性作用。纳米粒作为一种新型药物递送系统，具有提高药物稳定性、增加药物靶向性、改善药物药代动力学和药效学特性等优势。将辛伐他汀制备成纳米粒，有望增强其对血管内皮细胞的保护作用，更有效地抑制LPS诱导的细胞凋亡。然而，目前关于辛伐他汀纳米粒对LPS刺激的HUVECs凋亡影响的研究尚未见报道。因此，本研究旨在探究辛伐他汀纳米粒对LPS刺激的HUVECs凋亡的影响，并初步探讨其潜在作用机制，为拓展辛伐他汀纳米粒在炎症相关血管内皮损伤治疗中的应用提供理论依据。

二、材料与方法

（一）实验材料

细胞株：人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购自中国典型培养物保藏中心。

主要试剂：辛伐他汀（Sigma公司）、脂多糖（LPS，Sigma公司）、二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）、胎牛血清（FBS，Gibco公司）、DMEM培养基（Gibco公司）、胰蛋白酶-EDTA消化液（Gibco公司）、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（BD公司）、RIPA裂解液（碧云天生物技术有限公司）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司）、兔抗人Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3多克隆抗体（CellSignalingTechnology公司）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（CellSignalingTechnology公司）、ECL化学发光试剂盒（Millipore公司）。

主要仪器：CO?培养箱（ThermoFisherScientific公司）、倒置相差显微镜（Olympus公司）、高速冷冻离心机（Eppendorf公司）、流式细胞仪（BD公司）、蛋白质电泳系统（Bio-Rad公司）、化学发光成像系统（Tanon公司）。

（二）辛伐他汀纳米粒的制备

采用乳化-溶剂挥发法制备辛伐他汀纳米粒。具体步骤如下：称取一定量的辛伐他汀和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），溶解于二氯甲烷中作为油相；将聚乙烯醇（PVA）溶解于超纯水中作为水相。在磁力搅拌下，将油相缓慢滴入水相中，继续搅拌2h，使二氯甲烷充分挥发，得到辛伐他汀纳米粒混悬液。通过透射电子显微镜（TEM）观察纳米粒的形态，激光粒度仪测定其粒径和电位。

（三）细胞培养与分组处理

将HUVECs接种于含10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO?培养箱中培养。待细胞生长至80%-90%融合时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，进行传代培养。实验分为以下5组：

正常对照组：正常培养的HUVECs，不做任何处理。

LPS模型组：向细胞培养液中加入LPS，终浓度为1μg/mL，刺激24h。

辛伐他汀纳米粒低浓度组：先加入不同浓度（5μmol/L）的辛伐他汀纳米粒，孵育2h后，再加入LPS（1μg/mL）刺激24h。

辛伐他汀纳米粒中浓度组：先加入不同浓度（10μmol/L）的辛伐他汀纳米粒，孵育2h后，再加入LPS（1μg/mL）刺激24h。

辛伐他汀纳米粒高浓度组：先加入不同浓度（20μmol/L）的辛伐他汀纳米粒，孵育2h后，再加入LPS（1μg/mL）刺激24h。

（四）细