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PCR技术试题及答案

一、选择题（每题5分，共30分）

PCR反应中，负责催化子链DNA合成的酶是（）

A.解旋酶B.TaqDNA聚合酶C.限制性核酸内切酶D.DNA连接酶

PCR反应的三个基本步骤依次是（）

A.退火→变性→延伸B.变性→退火→延伸C.延伸→变性→退火D.变性→延伸→退火

下列哪项不是PCR反应体系的必需成分（）

A.模板DNAB.引物C.ATPD.dNTP（脱氧核苷三磷酸）

PCR反应中，“变性”步骤的主要目的是（）

A.让引物与模板结合B.打开DNA双链形成单链C.合成子链DNAD.终止反应

若要通过PCR扩增某段长度为500bp的DNA，循环次数一般至少需要（）

A.10次B.20次C.30次D.40次

实时荧光定量PCR（qPCR）与普通PCR的主要区别是（）

A.不需要引物B.可实时监测扩增产物量C.不需要Taq酶D.只能扩增短片段DNA

二、填空题（每空3分，共30分）

PCR技术的全称是________，其核心原理是通过________实现DNA片段的体外大量扩增。

PCR反应体系中，引物通常是长度为________bp的单链DNA，其作用是________。

延伸步骤的温度一般设置为________℃，该温度是TaqDNA聚合酶的最适催化温度。

若PCR产物电泳后出现“拖带”现象，可能的原因是________（写出1点即可）。

当需要扩增RNA病毒的核酸时，需先进行________反应合成cDNA，再进行常规PCR，该技术称为________。

引物设计时，应避免引物自身形成________结构，否则会影响引物与模板的结合。

三、简答题（每题10分，共20分）

简述PCR反应中“退火温度”过高或过低分别会导致什么问题？如何调整？

普通PCR扩增后，若电泳检测无目标条带，可能的原因有哪些？（至少写出3点）

四、应用题（20分）

已知某目的基因的部分DNA序列为：5’-ATGCGGCTAGCTACGATCAG-3’（上游链）、3’-TACGCCGATCGATGCTAGTC-5’（下游链），请设计一对用于扩增该片段的引物（引物长度为20bp），并说明设计依据。

答案

一、选择题

B（解析：Taq酶耐高温，可在PCR循环的高温条件下催化子链合成；解旋酶用于体内DNA解旋，PCR中通过高温变性解旋，无需解旋酶）

B（解析：变性（90-95℃，解链）→退火（50-65℃，引物结合）→延伸（70-75℃，子链合成），为PCR标准循环步骤）

C（解析：PCR需dNTP提供合成子链的原料，ATP非必需；模板、引物、Taq酶、dNTP、缓冲液为核心成分）

B（解析：变性通过高温破坏DNA双链间的氢键，形成单链模板，为引物结合做准备）

B（解析：PCR产物量呈指数增长，2^20≈10^6，20次循环可满足一般实验的扩增需求）

B（解析：qPCR通过荧光信号实时监测扩增过程，可定量分析初始模板量；普通PCR仅能终点检测产物）

二、填空题

聚合酶链式反应；DNA半保留复制

18-25；与模板DNA两端的互补序列结合，为Taq酶提供延伸起点

72（解析：Taq酶在72℃时催化效率最高，可高效合成子链）

引物浓度过高/退火温度过低/DNA模板不纯（任写1点即可）

逆转录（以RNA为模板合成cDNA）；RT-PCR（逆转录PCR）

发夹（自身互补形成的二级结构，会降低引物与模板的结合效率）

三、简答题

①退火温度过高：引物与模板DNA的互补结合能力下降，导致引物无法有效结合，扩增效率降低甚至无产物；

调整方式：适当降低退火温度（可根据引物Tm值，每次降低2-3℃梯度测试）。

②退火温度过低：引物与模板的非特异性结合增加，易形成非目标条带（杂带）；

调整方式：适当提高退火温度（以不出现杂带且有目标条带为最佳）。

①模板DNA质量差（如含有蛋白酶、核酸酶，导致模板降解）；

②引物设计不合理（如引物间形成二聚体、引物与模板无互补序列）；

③TaqDNA聚合酶失活（如未低温保存、反复冻融）；

④反应体系成分缺失（如漏加dNTP、引物）；

⑤退火温度过高（引物无法结合模板）（任写3点即可）。

四、应用题

上游引物（与上游链5’端互补）：5’-ATGCGGCTAGCTACGATCAG-3’（20bp）

下游引物（与下游链3’端互补，即与上游链3’端