植物生物工程实验二植物的提取详解.pptVIP

植物生物工程实验二植物的提取详解演示文稿;（优选）植物生物工程实验二植物的提取;保证DNA一级结构的完整性

排除其它分子的污染

RNA、蛋白质、多糖等;DNA存在部位;基因组DNA的提取

CTAB法

SDS法

质粒DNA的提取

碱裂解法

煮沸法

线粒体、叶绿体DNA的提取

差速离心结合SDS裂解法;在浓氯化钠溶液(1～2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来.;CTAB法原理;CTAB提取缓冲液的经典配方;SDS法;组份;DNA提取基本步骤;基因组DNA

新鲜材料，低温保存

细胞培养时间不能过长;基因组DNA

材料过多影响裂解，导致DNA量少，纯度低

针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：

植物材料－－液氮研磨

培养细胞－－蛋白酶K;采用吸附材料吸附分离DNA，应提供相应的缓冲体系

采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀

离心分离两相时，应保证一定的转速和时间

针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法;多糖的去除：

多糖水解酶;预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀

加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀

晾干DNA，让乙醇充分挥发;DNA质量检测;A：测DNA：

纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。

1)OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。

2)小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；

3)OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。

注：可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。;琼脂糖电泳;DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。

注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。

当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作;根据OD260定量：;当前第22页\共有40页\编于星期四\8点;PCR实验原理;DNA复制（replication）;当前第25页\共有40页\编于星期四\8点;当前第26页\共有40页\编于星期四\8点;;一般PCR反应条件;仪器药品;实验步骤;贮存液;贮存液;异丙醇；70%乙醇；90%乙醇；10mg/mlEB;操作流程;6. 重复第3、第4步。

7. 每支离心管中加入等体积异丙醇（400－500μl）。上下颠倒几次，4℃静置20分钟（或－20℃，15分钟）。（异丙醇用于沉淀DNA）

8. 14，000rpm离心20分钟。小心倒出上清夜，避免DNA颗粒丢失。倒置离心管，空气干燥（1－2分钟）。

9. 用1ml70％乙醇清洗DNA（3分钟），14,000rpm离心30分钟。小心倒出70%乙醇，用1ml90％乙醇清洗DNA，14,000rpm离心30分钟，小心地倒去乙醇。倒置离心管，空气中干燥，或用真空泵干燥15分钟。（乙醇用于去除低分子量寡核苷酸和核苷三磷酸）

10. 以150μlT10E1或蒸馏水溶解DNA，加入1～2μl不含DNA酶的RNA酶A（10mg/ml）。37℃反应1小时。

11. 4℃保存（－20℃长期保存）。;冷却至

室温;琼脂糖凝胶电泳;3.胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg/mL。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入1×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。

;加样：取10μLDNA样品与2μL6×上样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝