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鸡传染性支气管炎病毒IBVN基因和M基因原核表达及N蛋白间接ELISA方法的建立与探究

一、引言

1.1研究背景与意义

鸡传染性支气管炎（InfectiousBronchitis，IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（InfectiousBronchitisVirus，IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病，对全球养鸡业造成了巨大的经济损失。国际兽疫局（OIE）将其列为B类动物疫病，足见其对家禽养殖业的严重威胁。

IBV具有高度的传染性和致病性，感染范围广泛，可导致鸡只出现呼吸道、肾脏、生殖系统等多方面的病变。在呼吸系统方面，病鸡表现出咳嗽、喷嚏、气管啰音等症状，严重影响其呼吸功能；肾脏病变可导致肾型传支，病鸡出现精神不振、拉水样稀便等症状，死亡率显著增加；生殖系统受侵害时，产蛋鸡群开产推迟或无高峰，产蛋量下降，蛋壳质量变差，如出现软蛋、畸形蛋等，给蛋鸡养殖带来极大损失。此外，IBV还会使鸡群的生长速度减慢、饲料转化率下降，进一步增加养殖成本。

IBV属于冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链RNA病毒。其血清型众多，目前至少已发现29种，且新的血清型和变异株仍在不断出现。这种高度的变异性使得各血清型之间的交叉免疫性较弱，给疫苗的研发和防控工作带来了极大的挑战。例如，我国鸡传支流行株包括Mass、T、Hofle、Gray株以及大量的变异毒株，不同地区的流行优势血清型也有所不同。

IBV主要通过空气飞沫、接触传播等方式在鸡群中迅速传播，尤其是在集约化养殖环境中，疫情传播更为迅速，1-2天内即可感染全群。此外，被污染的饲料、饮水及饲养用具也可成为传播媒介。该病一年四季均可发生，但以冬春季节多发，鸡群拥挤、过热、过冷、通风不良、缺乏维生素和矿物质等因素均可促使本病的发生。

准确、快速地诊断IBV感染对于养鸡业的防控至关重要。目前，常用的诊断方法包括病毒分离鉴定、血清学诊断和分子生物学诊断等。然而，病毒分离鉴定方法耗时较长，实验要求高，在实际生产中应用受限；血清学诊断方法如琼脂凝胶沉淀试验、病毒中和试验与血凝抑制试验等，存在敏感性差、操作复杂、耗时费力等问题，难以满足大规模检测的需求。

原核表达技术为获取高纯度的病毒蛋白提供了有效途径。通过将IBV的关键基因（如N基因和M基因）克隆到原核表达载体中，转化大肠杆菌进行表达，并优化表达条件，可以获得大量具有生物学活性的重组蛋白。这些重组蛋白不仅可以用于研究病毒的结构与功能，还可作为诊断抗原用于开发敏感、特异的诊断方法。

酶联免疫吸附试验（ELISA）以其敏感、客观、成本低廉等优点，在传染病的诊断和抗体检测中得到了广泛应用。建立基于重组N蛋白的间接ELISA方法，能够实现对IBV抗体的快速、准确检测，为IBV感染的诊断、免疫效果评估以及流行病学调查提供有力工具。通过检测鸡群中的抗体水平，可以及时了解鸡群的免疫状态，为制定合理的免疫程序提供依据，从而有效预防和控制IBV的传播。

本研究旨在通过对IBVN基因和M基因进行原核表达，获得高纯度的重组蛋白，并以重组N蛋白为包被抗原，建立间接ELISA方法，为鸡传染性支气管炎的诊断、防控和疫苗研制提供重要的技术支持，具有重要的理论意义和实际应用价值。

1.2国内外研究现状

在IBV的研究领域，针对N基因和M基因原核表达以及N蛋白间接ELISA方法建立的探索一直是热点。国内外众多学者从不同角度展开研究，取得了一系列成果，同时也存在一些有待完善的地方。

国外方面，对于IBV的研究起步较早。在基因原核表达研究中，[国外研究团队1]成功将IBVN基因克隆到原核表达载体中，并在大肠杆菌中实现表达，通过优化表达条件，获得了具有一定纯度的重组N蛋白，为后续的研究奠定了基础。他们还对重组N蛋白的结构和功能进行了初步分析，发现其具有与天然N蛋白相似的抗原性。[国外研究团队2]则专注于M基因的原核表达，通过构建高效表达载体，在不同的大肠杆菌菌株中进行表达尝试，最终筛选出最佳的表达体系，实现了M基因的高效表达，并对表达产物进行了纯化和鉴定，为深入研究M蛋白在病毒感染过程中的作用提供了物质基础。

在N蛋白间接ELISA方法建立方面，[国外研究团队3]率先以重组N蛋白为包被抗原，建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法。他们对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了系统评估，结果显示该方法能够准确检测出感染IBV鸡血清中的抗体，与其他禽类病毒抗体无明显交叉反应，具有较高的特异性和敏感性。然而，该方法在实际应用中仍存在一些问题，如检测成本较高、操作步骤相对繁琐等。

国内在这方面的研究也取得了显著进展。在基因原核