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四种天麻基于SLAF测序的SNP标记开发与分析

1.基于SLAF测序的天麻SNP标记开发与分析：样本采集与预处理

选择不同地理区域、生态环境下的天麻样本，涵盖野生和人工栽培类型，每种类型选取2030个个体，以确保样本的遗传多样性和代表性。采集新鲜、健康的天麻叶片或幼嫩组织，迅速放入液氮中速冻，随后转移至80℃超低温冰箱保存。

采用改良的CTAB法提取天麻基因组DNA，具体步骤为：将冻存的组织在液氮中研磨成粉末，加入预热的CTAB提取缓冲液，65℃水浴1小时，期间轻柔颠倒混匀数次。冷却后加入等体积的氯仿异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀，12000rpm离心10分钟，取上清。重复抽提步骤23次，直至中间层无杂质。向上清中加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，可见白色絮状DNA沉淀。10000rpm离心5分钟，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀23次，晾干后用TE缓冲液溶解DNA。

使用Nanodrop核酸蛋白分析仪检测DNA的浓度和纯度，要求OD260/OD280比值在1.82.0之间，OD260/OD230比值大于2.0。同时，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，确保DNA条带清晰，无明显降解。将合格的DNA样本稀释至50100ng/μL，用于后续的SLAF文库构建。

2.基于SLAF测序的天麻SNP标记开发与分析：SLAF文库构建与测序

根据天麻基因组信息（若已有参考基因组）或相关近缘物种基因组信息，选择合适的限制性内切酶。例如，选择HaeIII和MseI双酶切组合，能产生大量长度适中的酶切片段，有利于SLAF标签的形成。将稀释好的DNA样本进行酶切反应，反应体系为50μL，包含DNA2μg、10×酶切缓冲液5μL、HaeIII5U、MseI5U，37℃酶切34小时。

酶切产物经过纯化后，进行连接反应。向纯化后的酶切产物中加入接头，接头包含特异性的条形码序列，用于区分不同样本。连接反应体系为20μL，包含酶切产物、T4DNA连接酶、连接缓冲液等，16℃连接过夜。连接产物通过PCR扩增，扩增体系为50μL，包含连接产物、PCR引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs等，扩增条件为95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。

PCR产物经过纯化和片段筛选，选择长度在300500bp之间的片段作为SLAF标签。将筛选后的SLAF标签混合后，采用IlluminaHiSeq测序平台进行双端测序，测序读长为150bp。测序过程中，严格控制测序质量，确保测序数据的准确性和可靠性。

3.基于SLAF测序的天麻SNP标记开发与分析：测序数据处理与SNP标记挖掘

对测序得到的原始数据进行质量控制，去除低质量的reads（如质量值低于20的碱基比例超过50%）、含接头污染的reads以及长度过短的reads。使用Trimmomatic软件进行数据过滤和修剪，设置合适的参数，保证数据的高质量。

将过滤后的reads与天麻参考基因组（若有）进行比对，若没有参考基因组，则进行denovo组装。使用BWA软件进行比对，参数设置为默认值。比对后，使用SAMtools软件将比对结果转换为BAM格式，并进行排序和索引。

基于比对结果，使用GATK软件进行SNP标记的挖掘。首先进行碱基质量重校准，然后进行SNP检测和基因型分型。设置最小覆盖度为5，最小等位基因频率为0.05，以确保SNP标记的可靠性。对挖掘到的SNP标记进行注释，分析其在基因组中的位置、功能等信息。例如，使用ANNOVAR软件将SNP标记注释到基因的不同区域，如外显子、内含子、启动子等，分析其可能的生物学功能。

4.基于SLAF测序的天麻SNP标记开发与分析：SNP标记的验证与分析

随机选取部分挖掘到的SNP标记，采用Sanger测序法进行验证。设计针对这些SNP位点的特异性引物，以天麻基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物送测序公司进行Sanger测序。将Sanger测序结果与SLAF测序得到的SNP信息进行比对，计算验证率。一般要求验证率达到80%以上，才能认为挖掘到的SNP标记可靠。

分析SNP标记的多态性信息含量（PIC），PIC值反映了SNP标记在群体中的多态性程度。使用PowerMarker软件计算PIC值，PIC值大于0.5的SNP标记为高度多态性标记，可用于后续的遗传分析。

基于SNP标记数据，进行群体遗传结构分析。使用Structure软件进行群体结构推断，设置不同的K值（群体数量），通过多次运行确定最佳的K值。同时，使用GenAlEx软件计算群体间的遗传距离、遗传分化系数（Fst）等参数，分析不同天麻群体之间的遗传关系和分化程度。还可以进行系统发育