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21三体综合征产前诊断

;案例;;;;荧光原位杂交（FISH）;材料

???仪器?离心机，水浴锅，恒温培养箱，荧光显微镜。

试剂?

荧光探针。工作液的配制：（1）20×SSC：氯化钠175g，柠檬酸三钠88.2g，加三蒸水到1000ml。（2）变性液：甲酰胺28ml，20×SSC 4ml，蒸馏水8ml，终体积40ml，充分混匀，调整pH至7.0～8.0,密封保 存于4℃～8℃,每次使用前均需测定pH值。（3）洗脱液：甲酰胺 20ml，20×SSC4ml，蒸馏水16ml，终体积40ml。（4）SSCT： 20×SSC100ml，Tween-200.2ml，加二蒸水至终体积为1000ml。

方法

1.羊水细胞涂片的制备

?抽取羊水5～6ml，1500rpm离心10min，去上清，留羊水细胞沉淀；在细胞沉淀中加3ml0.25%trypsin（溶于无CaCl2的Hanks液），37℃消化30min；2000rpm离心10min，去上清，在沉淀中加入4～5ml0.75mol/LKCl,37℃孵育30min，再加入1ml固定液（甲醇∶冰醋酸为3∶1），轻轻混匀，2000rpm离心10min，去上清，加5ml固定液，轻轻混匀，2000rpm离心10min，去上清，加适量固定液，滴片。

?2.杂交、洗脱、显色

?(1)将pH为7.0～7.5的变性液(70%甲酰胺/2×SSC)放入水浴中预热至74℃,将一支干净的温度计插入变性液中以确认温度达到了74℃，注意冷玻片插入变性液中将降低变性液的温度。(2)将玻片插入预热的变性液中3～4min，不要摇动，然后迅速将玻片插入预冷至-20℃的酒精中，依次从70%、90%到100%酒精中各脱水2min。(3)将探针于37℃保温5min，轻轻振动后短暂离心收集液体于管底（不要变性探针）。(4)用刻字笔将标本周围划线，加上10μl探针。盖上盖玻片，在盖玻片周围封上一层rubbercement，将玻片置于湿盒中于37℃杂交过夜。;(5)在水浴中预热40ml洗脱液（50%甲酰胺/2SSC）至43℃，将一支

干净的温度计插入洗脱液中证实温度达到43℃。

(6)用镊子小心地除去rubbercement，小心揭开盖玻片，将玻片插入洗脱液中洗脱10min，然后再重复一次。洗脱液的温度对于信号强度与特异性非常关键，洗脱液温度不能低于43℃。以免由于交叉杂交导致背景产生。

(7)将玻片在37℃的2×SSC中洗脱2次，每次4min。

(8)将玻片置于室温SSCT液中洗脱2min。

（9）将玻片取出，用纸巾从玻片边沿吸过量的SSCT，不要让玻片干掉，以免由于检??试剂的非特异性结合导致高背景荧光。

（10）在每块玻片上加上30μlavidin-FITC，盖上盖玻片，37℃孵育20min。

（11）小心去除盖玻片，将玻片在室温SSCT中洗脱3次，每次2mi

（12）用纸巾从玻片边沿吸过量的SSCT，加上30mlAnti-avidin于标本上，盖上盖玻片，37℃孵育20min。

（13）小心去除盖玻片，在室温的SSCT中洗脱3次，每次2min。

（14）在每块玻片上加上30μlavidin-FITC，盖上盖玻片，37℃孵育20min。

（15）小心去除盖玻片，在室温的SSCT中洗脱3次，每次2min。

（16）用纸巾从玻片边沿吸过量的SSCT加上10μlDAPI，盖上18mm×18mm盖玻片，用一块纸巾盖上盖玻片,小心挤压纸巾以吸去多余的DAPI,注意不要移动盖玻片。

3.荧光显微镜下观察.

;;;PCR-SSLP技术;结果

正常人在某一str位点可出现两种情况：

一．若为杂合子，pcr产物电泳结果显示2条DNA带，密度定量为1:1.

二．若为纯合子，pcr产物电泳结果显示1条DNA带。

Down综合征患者在某一str位点的检测结果分3种情况：一，显示为3条DNA带，密定量比为1:1:1；二，显示为2条DNA带，密度定量比为2:1；三，显示为1条DNA。

前两种提示：该str位点有3个等位基因，可对DOWN综合征作出诊断。

第三种提示：三个等位基因纯合型，不能做出诊断，需结合其他STR位点的检测结果综合分析。

本研究选6个STR位点分布于21号染色体长臂；D21S16位于21q11.1，D21S11位于21q22.1~q21；D21S1432位于21q21；D21S1437和D21S1270位于DSCR(关键区域)内部，D21S1446位于21q23.30。因此，选用上述6个STR位点，尤其是D21S1437，D21S1270两位点位于DSCR内部，以它们作为遗传标记，采用PCR—SSLP的方法