生物统计与实验设计检测技术.pptVIP

内容简介;等位基因和基因型

位于一对同源染色体的同一位置（基因型）上、控制相对性状的两个不同形式的基因叫等位基因。

一个基因由于突变（包括中性突变）可形成2个以上的等位基因，不同的等位基因可产生不同的遗传特征的变化，同时控制相对性状的显、隐性关系和遗传效应。如由突变形成的多种等位基因可产生多种异常表型。;正常基因称为野生型基因：具有野生型基因的细胞或个体称为野生型（wildtype）。

基因突变（genemutation）：携带突变基因的各种类型的细胞或个体称为突变体或突变型（mutant）。;一、SNP的概念;二、SNP在基因组内的形式:;三、SNP的特点;（3）遗传稳定性与微卫星等重复序列多态性标

记相比,SNP具有更高的遗传稳定性。

（4）易实现分析的自动化SNP标记在人群中

只有两种等位型(allele)。这样在检测时只需一个

“+\-”或“全\无”的方式，而无须象检测限制性片段长度多态性，微卫星那样对片段的长度作出测量，这使得基于SNP的检测分析方法易实现自动化。;四、多态性与突变的区别;五、SNPs经典检测方法;（一）PCR-RFLP方法;PCR-RFLP原理图;（二）单链构象多态性(SSCP);第十三页，共六十二页。;（三）变性梯度凝胶电泳（DGGE）;;（四）等位基因特异PCR(AS-PCR);第十七页，共六十二页。;PCR条件优化

TaqDNA聚合酶：

1-5U/100ul,浓度过高-非特异扩增，过低-产量不足。

dNTP:

20-200μmol/L,四种浓度要相等，任何一种不等都会发生错配。

Mg++浓度：

0.5-2.5mmol/L,一般反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为为宜，过高-非特异性，过低-酶活性降低。

引物浓度：

μmol/L,过高—错配、特异扩增，二聚体;模版浓度、质量

100-200ng/100ul

偏向性扩增的解决

所谓偏向性扩增是因为SNP位点上会往往存在嘌吟和嘧啶的替换，在PCR过程中，聚合反应对嘧啶(C或T)比较敏感，使得嘌吟(A或T)的扩增非常少，而出现偏向性扩增，这在SNP位点附近嘌吟含量较高时特别明显。

解决方案：（1）PCR扩增循环保持一个绝对低的水平；（2）在样本中加入0.1NNaOH使DNA变性为单链，经中和后加入全基因组扩增试剂。（3）巢式PCR-RFLP”基因分型技术;AAAAGGAAGATCCCAA

TTTTCCTTCTAGGGTT;QIAGENREPLI-g试剂盒;PCR反应出现的问题与对策

1、假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。二是空气中的小片段核酸污染;解决方法：

①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。

③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。;2、出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。;对策：

①必要时重新设计引物。

②减低酶量或调换另一来源的酶。

③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。;3、出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

③适当降低Mg2+浓度。

④增加模板量，减少循环次数。

;优点：这个方法是最便宜的，不需要酶切，一次PCR就可以得到GENOTYPING的信息。

缺点：PCR对于3端的特异性在不同退火温度时有出入，所以退火温度的摸索很关键，否则假阳性扩增是很容易的。

另外，内参照的设置也很重要，这个东西还是很有意思的。而且，所使用的引物位置无法