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实验一细胞色素C的制备及测定
一、实验目的
I.学习细胞色素C的理化性质及其生物学功能。
2.掌握制备细胞色素C的原理。
3.掌握制备细胞色素C的操技术。
二、实验原理
细胞色素C是呼吸链的一个重要组成成份。是一种含铁叶麻基团的蛋白质，在线粒体
呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间，细胞色素C的用是在生物氧化过程中传递
电子。
细胞色素C分子中含赖氨酸较高,所以等电点偏碱,为pH10.8,分子量为12000〜13000
道尔顿。它易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变性，组织破碎后，用酸性水溶液即能从
细胞中浸提出来。细胞色素C分为氧化型和还原型两种，因为还原型较稳定并易于保存，
一般都将细胞色素C制成还原型的，氧化型细胞色素C在408nm、530nm有最大吸收峰，
还原型细胞色素C的最大吸收峰为415nm、520nm和550nm,这一特性可用于细胞色素C
的含量测定。
由于细胞色素C在心肌组织和酵母中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。本实验
以猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸镀溶液洗脱，三氯醋酸沉淀等步骤制
备细胞色素C,并测定其含量。
三、实验材料
1.实验器材
绞肉机；电磁搅拌器；离心机；721型分光光度计；玻璃柱(2.5x30cm)；三角瓶；试管
(多支，25mL)烧杯(1000、500mL)；量筒；移液管；玻璃漏斗和纱布；玻璃棒；透析袋。
2.实验试剂
⑴2MH2s04溶液；1MNH40H溶液；固体硫酸镂
⑵25%硫酸镀溶液：100mL蒸储水中含25克硫酸镂，约相当于25℃时40%的饱和度
⑶0.2%氯化钠溶液：称0.2克氯化钠，用蒸镭水溶解并定容至100ml.
⑷BaCl试剂：称12克BaCl,溶于100ml蒸储水中。
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⑸20%三氯醋酸溶液
(6)人造沸石
⑺联二亚硫酸钠N（a2s2O2H2O）
三、实验操
1.细胞色素C的制备
⑴材料处理：
取新鲜或冰冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心切成小块，放入绞肉机绞
碎。
2.提取：
称取绞碎猪心肌肉100克，放人500mL烧杯中，加蒸储水200ml,以2MH2sO4调pH
至4.0此（时溶液呈暗紫色），在室温下搅拌提取1小时，在提取过程，使抽提液的pH值保持
在4.0左右。在即将提取完毕，停止搅拌之前，以IMNH40H调pH至6.0,停止搅拌。离
心3000/min,lOmin或（用8层纱过滤），收集上清液。残渣加入150mL蒸储水，再按上
述条件提取1小时，两次提取液合并。
3.中和:
用1MNH40H调上述提取液至pH7.2此（时，等电点接近7.2的一些杂蛋白溶解度小，
从溶液中沉淀下来），静置30〜40分钟，收集上层澄清液；将下层悬浮液，离心3000/min,
lOmin或（纱过滤），取上清液与前面的液体混合，待上柱。
4.吸附与洗脱：
人造沸石容易吸附细胞色素C,吸附后能被25%的硫酸镂洗脱下来，利用此特性将细
胞色素C与其它杂蛋白分开。具体操作如下：
①人造沸石的预处理：称取人造沸石约10g,放入500mL烧杯中，加水搅拌，用倾泻
法除去12秒钟内不下沉的过细颗粒。
②装柱：选择一个底部带有滤膜的干净的玻璃柱2（.5x30cm）,柱中加入蒸储水至2/3
体积，保持柱垂直，然后将己处理好的人造沸石带水装填人柱，注意一次装完，避免柱内出
现气泡（约12~15cm）o
③上样
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