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小麦品系L224-3苗期及成株抗叶锈病基因的分子作图

摘要

叶锈病（PucciniatriticinaEriks.）是影响世界小麦生产的重要病害之一。培育和利用抗病品种是控制该病害最为经济、有效和环境友好的措施。然而，随着病原菌新小种的不断产生和流行，小麦品种抗性常因小种变化而“丧失”，导致抗病品种使用寿命缩短。因此，不断发掘和利用新的抗叶锈病基因对小麦抗病育种具有重要意义。本研究通过基因推导和SSR标记技术，对小麦新品系L224-3携带的抗叶锈病基因进行分子作图，为进一步克隆该基因及培育持久抗叶锈病小麦品种奠定基础。

关键词

小麦；叶锈病；基因推导；SSR标记；分子作图

一、引言

小麦叶锈病是由小麦叶锈菌（PucciniatriticinaEriks.）引起的一种重要世界性病害。在适宜的发病条件下，小麦叶锈病流行可造成小麦产量损失10%-30%，严重时可达50%以上，同时还会导致小麦品质下降。目前，培育和种植抗病品种是控制小麦叶锈病最为经济、有效和环保的措施。然而，由于叶锈菌生理小种的高度变异性，使得小麦品种的抗锈性易于丧失，因此，不断发掘和利用新的抗叶锈病基因，对于小麦抗锈病育种工作具有重要意义。

小麦品系L224-3是河南省黄泛区农场农业科学研究所选育的一个高抗叶锈病和条锈病的小麦新品系。在多年的田间试验中，该品系对叶锈病表现出良好的苗期和成株抗性。为了明确L224-3所携带的抗叶锈病基因，本研究利用基因推导和分子标记技术对其进行了研究，旨在为小麦抗叶锈病育种提供新的基因资源和理论依据。

二、材料与方法

2.1试验材料

2.1.1小麦材料

供试小麦材料包括小麦品系L224-3、感病对照品种郑州5389以及由L224-3与郑州5389杂交获得的144个F2:3家系。此外，还选用了36个携带已知抗叶锈病基因的小麦单基因系，用于基因推导分析。

2.1.2叶锈菌生理小种

选用了15个具有代表性的小麦叶锈菌生理小种，包括FHBQ、THTT、THTQ等，用于苗期接种鉴定。这些生理小种由中国农业科学院植物保护研究所提供，并在本实验室保存和繁殖。

2.2试验方法

2.2.1基因推导

将36个已知抗叶锈病基因的单基因系和L224-3在温室中进行苗期种植，待第一片真叶完全展开时，采用涂抹法接种15个叶锈菌生理小种。接种后将麦苗置于保湿箱中，在18-20℃、相对湿度95%-100%的条件下保湿24h，然后转入温室培养，温度控制在20-22℃，光照16h/d。接种后10-14d，按照Stakman等的标准记载反应型（infectiontype，IT），根据已知单基因系对不同生理小种的反应型，推导L224-3可能携带的抗叶锈病基因。

2.2.2遗传分析

选用对L224-3表现为毒性，而对郑州5389表现为无毒性的叶锈菌生理小种FHBQ，对L224-3×郑州5389的144个F2:3家系进行苗期接种鉴定。每个家系种植10株，接种方法同基因推导。接种后按照上述标准记载反应型，以家系为单位统计抗感分离比例，采用卡方检验分析抗叶锈病性状的遗传规律。

2.2.3DNA提取

采用CTAB法分别提取L224-3、郑州5389以及F2:3家系单株的基因组DNA。将提取的DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度，将DNA浓度调整至50ng/μL，保存于-20℃备用。

2.2.4SSR标记筛选及PCR扩增

选用分布于小麦21条染色体上的1276对SSR引物和1对STS引物ω-secalin/glu-B3，对L224-3和郑州5389进行多态性筛选。PCR扩增体系为20μL，包括10×PCRbuffer2μL，2.5mmol/LdNTPs1.6μL，10μmol/L引物各1μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL，50ng/μL模板DNA2μL，ddH2O12.2μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55-65℃（根据引物退火温度而定）退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸10min。扩增产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色后观察记录结果。

2.2.5连锁分析及基因定位

利用多态性引物对F2:3家系进行PCR扩增，根据扩增结果统计各标记基因型。采用MapMaker/EXP3.0软件进行连锁分析，LOD值设为3.0，计算标记间的遗传距离（cM），并构建遗传连锁图谱。利用Map