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酶法驱动下多肽的PEG/HA定点修饰及药学性质探究

一、引言

1.1研究背景

多肽一般指α-氨基酸以肽键连接形成的化合物，其作为药物具有生物功能明确、作用专一、毒性低等优点，在临床上已被广泛用于刺激造血、抗肿瘤、免疫调节等多个重要领域。例如，胰岛素作为一种典型的多肽药物，在糖尿病治疗中起着不可或缺的作用，它能够精准地调节血糖水平，保障患者的身体健康；还有催产素，可用于引产或应对子宫收缩不全等情况，通过刺激子宫平滑肌收缩，有效增强宫缩力量。这些实例充分展示了多肽药物在医疗领域的重要价值和广泛应用前景。

然而，多肽药物也存在一些明显的不足。一方面，多肽的分子量较小，这使得它们在体内极易被代谢降解，导致其药效持续时间较短。药物进入人体后，会迅速受到各种酶的作用，多肽结构被破坏，从而失去活性，无法长时间维持有效的治疗效果。另一方面，多肽的膜穿透性较差，难以有效地通过生理屏障，这在很大程度上限制了它们的给药途径，目前主要依赖注射给药，给患者带来了不便和痛苦，也影响了患者的用药依从性。

为了克服多肽药物的这些缺点，以聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）等聚合物进行化学修饰被认为是一种简单且有效的策略。PEG是一种由环氧乙烷聚合而成的无毒、高亲水性大分子聚合物，具有良好的水溶性。将PEG与多肽进行共价结合，即聚乙二醇化修饰，能够显著改善多肽药物的药代动力学和药效学性质。PEG的空间位阻效应可以减少多肽与蛋白酶的接触，从而降低多肽的酶解速率，延长其在体内的半衰期。同时，PEG的亲水性能够提高多肽的水溶性，增强其在溶液中的稳定性，减少聚集现象的发生。此外，聚乙二醇化修饰还可以降低多肽的免疫原性，减少机体对多肽药物的免疫反应，提高药物的安全性和耐受性。

透明质酸（hyaluronicacid，HA）是一种天然的线性多糖，由N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸重复单元组成，广泛存在于人体的结缔组织、皮肤、关节液等部位，具有优异的生物相容性、吸水性、高粘弹性以及非抗原性等特点。将HA用于多肽修饰，可以赋予多肽一些独特的性能。HA的亲水性和高粘性能够增加多肽的水溶性和稳定性，同时，HA在体内可被透明质酸酶降解，具有良好的生物可降解性，这使得HA修饰的多肽在体内能够缓慢释放，延长药效持续时间。此外，HA对某些细胞表面的受体具有特异性亲和力，能够实现多肽药物的靶向递送，提高药物的疗效。

1.2研究目的与意义

本研究旨在利用来源于茂源链霉菌（Streptomcyesmobaraensis）的微生物转谷氨酰胺酶（microbialtransglutaminase，mTGase）实现多肽药物的PEG/HA高效、定点修饰。mTGase可以催化谷氨酰胺（glutamine，Gln）的γ-甲酰胺基和赖氨酸（lysine，Lys）的伯胺基之间形成新的酰胺键，通过这种酶催化的方式，能够精准地将PEG或HA连接到多肽的特定残基上，实现定点修饰，从而克服传统化学修饰方法中存在的反应位点选择性差、修饰率低及易导致活性损失等问题。

本研究具有重要的理论意义和实际应用价值。在理论方面，深入研究mTGase催化的多肽PEG/HA定点修饰反应机制，有助于进一步揭示酶催化反应的规律，丰富和完善多肽修饰的理论体系，为后续的多肽修饰研究提供新的思路和方法。在实际应用方面，通过获得PEG/HA修饰的多肽，能够显著改善多肽药物的药效持续时间和生物利用度，优化其药代动力学和物理化学性质，为开发新型多肽药物奠定坚实的基础。这将有助于推动多肽药物在临床治疗中的更广泛应用，提高疾病的治疗效果，为患者带来更多的福祉。

1.3研究内容与方法

本研究以含Gln或Lys残基的胸腺五肽（thymopentin，TP5；氨基酸序列为RKDVY）、抗肿瘤多肽PCK3145（氨基酸序列为EWQTDNCETCTCYGT）以及设计的抗血管生成活性多肽ES2-TH（氨基酸序列为IVRRADRAAVPGGCGKRK）为研究对象，开展以下研究内容：

PEG-多肽缀合物的酶法合成与表征：首先，通过将mTGase的二肽底物苄氧羰基-L-谷氨酰胺-甘氨酸（benzyloxycarbonyl-L-glutamine-glycine，ZQG）的羧基经EDC/NHS活化后，与叔丁基胺聚乙二醇胺（BOC-PEG-NH2）的氨基反应，合成PEG-ZQG，并对其进行表征。然后，在mTGase的催化下，使含单一Lys残基的TP5与PEG-ZQG的Gln残基共价相连，制备PEG-TP5，并通过Superdex30凝胶柱纯化，利用HPLC、1HN