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细胞渗透性实验操作步骤

细胞作为生命活动的基本单元，其膜结构的完整性与通透性是维持细胞正常生理功能的关键。细胞渗透性实验，作为研究细胞膜特性、评估药物或外界因素对细胞影响的重要手段，在生物医学、药理学等领域有着广泛的应用。本文将从实验原理出发，详细阐述细胞渗透性实验的标准操作流程，旨在为科研工作者提供一份专业、严谨且具有实际指导意义的操作指南。

一、实验原理简述

细胞渗透性实验主要基于细胞膜对特定物质的选择透过性。正常情况下，细胞膜允许水分子自由通过，而对大多数溶质分子具有屏障作用。当细胞所处的渗透压环境发生改变，或细胞膜受到物理、化学因素影响时，其通透性会发生相应变化。本实验通常借助一些不易透过正常细胞膜的染料（如台盼蓝）或荧光探针，通过观察细胞对这些物质的摄取情况，或监测细胞体积变化、特定离子的跨膜流动等指标，来间接反映细胞膜的通透性状态。例如，活细胞的细胞膜完整，台盼蓝无法进入；而受损或死亡细胞的细胞膜通透性增加，染料得以渗入并使细胞着色。

二、实验材料准备与试剂配制

开展细胞渗透性实验前，需确保所有材料与试剂的质量与适用性。

主要实验材料：

*处于对数生长期的目标细胞株（确保细胞活力良好，形态均一）

*细胞培养皿或培养板（根据实验规模与检测方式选择合适规格）

*移液枪及配套无菌吸头（不同量程以满足精确加样需求）

*离心机、超净工作台、CO?培养箱、倒置显微镜

*微量移液器、离心管、试管等

主要试剂：

*基础细胞培养液（如DMEM、RPMI-1640等，根据细胞类型选择）

*胎牛血清或其他适宜血清（用于细胞培养，需灭活处理）

*胰蛋白酶-EDTA消化液（用于贴壁细胞的消化传代）

*磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2-7.4，无钙镁）

*台盼蓝染色液（常用浓度为0.4%，使用前需过滤除菌）或其他选择的通透性指示剂（如荧光染料）

*实验处理因素（如不同浓度的药物、物理刺激等，需根据实验设计提前准备并稀释至所需浓度）

*（若采用荧光法）相应的荧光探针及其特异性抑制剂（如适用）

试剂配制注意事项：

*所有试剂均需使用超纯水或双蒸水配制。

*严格按照试剂说明书或标准protocol进行称量、溶解与定容。

*对热不稳定的试剂应注意低温操作。

*配好的试剂经0.22微米滤膜过滤除菌（如为细胞培养用），并分装保存于适宜条件（如4℃或-20℃），避免反复冻融。

*所有试剂瓶需清晰标记名称、浓度、配制日期及配制人。

三、细胞接种与预处理

细胞的良好状态是实验成功的基础。

1.细胞复苏与传代：从液氮或-80℃冰箱中取出冻存的细胞，快速复苏后，在适宜条件下进行培养。待细胞生长至70%-80%汇合度时，进行传代。贴壁细胞用胰蛋白酶-EDTA消化，吹打均匀后，按适当比例接种至新的培养器皿中，继续培养。

2.细胞计数与活力检测：实验前，取少量细胞悬液，用台盼蓝染色法进行细胞计数和活力检测。确保细胞活力在90%以上方可用于实验。

3.细胞接种：根据实验设计，将一定数量的细胞悬液接种到96孔板、24孔板或其他规格的培养板中。例如，若使用96孔板进行后续的光吸收或荧光检测，每孔可接种数千至数万细胞（具体数量需根据细胞大小和生长速度预实验确定），并加入适量完全培养液，轻轻晃动培养板使细胞分布均匀。

4.细胞贴壁与同步化：将接种好的细胞培养板放入CO?培养箱中，在37℃、5%CO?及饱和湿度条件下培养，使细胞充分贴壁和恢复生长（通常需要若干小时至overnight）。对于某些实验，可能需要对细胞进行血清饥饿等预处理，以实现细胞周期的同步化，减少实验误差。

四、实验处理与孵育

此阶段是施加实验因素，诱导细胞膜通透性变化的关键步骤。

1.药物或处理因素准备：将待测试的药物或处理因素用无血清培养液或PBS稀释至所需的一系列浓度。设置空白对照组（仅含细胞和培养液/缓冲液）、溶剂对照组（含细胞、培养液/缓冲液及药物溶解所用的溶剂）和不同处理浓度组。

2.更换培养液与加药处理：当细胞生长状态良好并达到实验要求的汇合度时，小心吸去培养板中的旧培养液（对于贴壁细胞，操作时避免直接吹打细胞）。用预热的PBS轻轻洗涤细胞1-2次，以去除残留的血清和代谢产物。随后，向各孔中加入含不同浓度处理因素的培养液或缓冲液，以及相应的对照液。确保每孔液体体积一致。

3.孵育处理：将加药后的培养板放回CO?培养箱中，在设定的温度和时间条件下孵育（孵育时间根据实验设计和预期效应确定，可从数十分钟到若干小时不等）。在此期间，避免频繁开启培养箱门，以维持稳定的培养环境。

五、渗透性指标检测

根据所选用的检测方法，进行细胞膜通透性的评估。以下以常用的台盼蓝排斥法和荧光