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细胞破碎分离与纯化

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目录

壹

细胞破碎技术

贰

细胞分离方法

叁

纯化技术原理

肆

纯化过程优化

伍

实验操作技巧

陆

案例分析与讨论

细胞破碎技术

章节副标题

壹

破碎方法概述

使用高压均质机、超声波细胞破碎仪等设备，通过物理力作用破坏细胞壁，实现细胞内容物释放。

机械破碎法

使用特定的酶如溶菌酶分解细胞壁，常用于细菌等微生物的破碎，保持细胞内组分的活性。

酶解破碎法

利用化学试剂如SDS、TritonX-100等溶解细胞膜，温和地释放细胞内物质，适用于敏感细胞。

化学破碎法

01

02

03

常用破碎设备

高压均质机通过高压泵将细胞悬浮液加压至数百甚至上千个大气压，然后突然释放压力，使细胞破碎。

高压均质机

超声波细胞破碎器利用超声波产生的高频振动和空化效应，使细胞膜破裂，适用于小规模细胞破碎。

超声波细胞破碎器

常用破碎设备

珠磨机通过高速旋转的珠子与细胞混合，利用珠子的撞击力破碎细胞，适用于大规模细胞破碎。

珠磨机

冻融法通过反复冻融细胞悬液，利用冰晶形成和融化时的物理作用力使细胞破裂，是一种简单易行的方法。

冻融法

破碎效果评估

通过测定细胞破碎后上清液中的蛋白质含量，评估破碎效率和细胞裂解程度。

蛋白质释放量测定

通过离心分离破碎液，检查沉淀与上清的分离情况，判断破碎是否充分。

离心分离效率

使用显微镜观察细胞破碎前后形态变化，直观评估破碎效果是否彻底。

显微镜检查

细胞分离方法

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贰

离心分离技术

差速离心通过改变离心速度分离不同大小或密度的细胞组分，如细胞器和大分子。

差速离心法

01

利用不同密度介质形成梯度，通过离心分离出具有不同密度的细胞或细胞器。

密度梯度离心

02

超速离心机提供更高的离心力，用于分离具有细微密度差异的生物大分子，如蛋白质复合体。

超速离心

03

沉淀分离技术

利用不同大小和密度的细胞或细胞器在离心力作用下沉降速率不同，实现分离。

差速离心法

01

02

通过建立密度梯度，使得细胞或细胞组分在离心过程中按密度分层，从而分离纯化。

密度梯度离心

03

在特定密度的介质中离心，使得目标细胞或颗粒在等密度层面上分离出来。

等密度离心

过滤分离技术

微孔过滤利用不同大小的孔径来分离细胞，适用于去除悬浮颗粒和大细胞。

微孔过滤

超滤通过半透膜分离小分子和大分子，常用于浓缩和纯化蛋白质等生物大分子。

超滤技术

离心过滤结合了离心力和过滤原理，能高效分离细胞和大颗粒杂质。

离心过滤

纯化技术原理

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叁

吸附纯化技术

利用特定吸附剂对目标分子的亲和力，通过物理或化学作用实现分离。

选择性吸附原理

离子交换树脂通过可逆的离子交换反应，有效去除溶液中的特定离子，实现纯化目的。

离子交换树脂

层析技术是吸附纯化的一种，通过不同物质在固定相和流动相中的迁移速率差异进行分离。

层析技术应用

层析纯化技术

利用带电分子与离子交换树脂间的相互作用，实现蛋白质等生物大分子的分离纯化。

离子交换层析

通过特定的生物分子相互作用，如抗原-抗体结合，高效纯化目标蛋白。

亲和层析

根据分子大小差异，通过凝胶介质的孔隙进行分离，常用于分子量的测定和纯化。

凝胶过滤层析

利用疏水性相互作用，分离具有不同疏水特性的蛋白质或其他生物分子。

疏水层析

膜分离纯化技术

微滤技术利用微孔膜分离悬浮颗粒，广泛应用于去除水中的细菌和微粒。

微滤技术

反渗透膜能阻挡溶解盐类和小分子，是海水淡化和废水处理的关键技术。

纳滤膜可分离小分子有机物和二价离子，适用于软化水和有机溶剂的回收。

超滤通过半透膜分离大分子物质，如蛋白质纯化，常用于生物制药行业。

超滤技术

纳滤技术

反渗透技术

纯化过程优化

章节副标题

肆

纯化条件选择

根据目标蛋白的性质和杂质的特性，合理安排纯化步骤的顺序，以提高纯度和收率。

温度对蛋白质的稳定性和活性有显著影响，需选择最佳温度以防止蛋白质变性。

缓冲液的pH值和离子强度需根据目标蛋白的特性进行优化，以提高纯化效率。

选择适宜的缓冲液

温度条件的优化

纯化步骤的顺序

纯化效率提升

选择合适的缓冲液pH和离子强度，可以提高目标蛋白的溶解度，减少非特异性吸附，提升纯化效率。

01

优化缓冲液条件

使用高分辨率的色谱柱和先进的色谱技术，如亲和色谱或离子交换色谱，可以显著提高纯化速度和纯度。

02

采用高效色谱技术

通过调整超滤膜的孔径大小和操作条件，可以有效去除小分子杂质，同时保留目标蛋白，提高纯化效率。

03

优化超滤步骤

纯化后处理

去除残留杂质

使用特定的缓冲液和离心步骤去除纯化过程中引入的盐类和其他小分子杂质。

浓缩目标蛋白

通过透析、超滤等方法浓缩目标蛋白，以达到实验所需的浓度。

稳定化处理

添加稳定剂如甘油或糖类，以防止蛋白质在储存过程中变性或聚集。

实验操作技巧