稳定表达Tet on 3G的Sf9细胞系构建及转基因粘虫品系的探索与实践.docxVIP

稳定表达Teton3G的Sf9细胞系构建及转基因粘虫品系的探索与实践

一、引言

1.1研究背景

鳞翅目昆虫是昆虫纲中物种数量排名第二的目，其中包含了许多重要的农业害虫，如棉铃虫、小菜蛾、粘虫等。对鳞翅目昆虫分子机理的研究，不仅有助于我们深入理解昆虫的生长发育、繁殖、行为等基本生物学过程，还能为害虫防治提供新的策略和方法。目前，对于鳞翅目昆虫的基因功能研究、信号通路解析等方面已经取得了一定的进展，但仍有许多未知领域等待探索。

Tet-On3g调控系统是一种基于四环素响应元件的基因表达调控系统。它主要由Tet反应元件（TRE）和改造后的反式激活因子Tet-on3G组成。在没有四环素或其衍生物（如多西环素，Dox）存在时，Tet-on3G不能与TRE结合，下游基因不表达；当加入Dox后，Dox与Tet-on3G结合，使其构象发生变化，从而能够与TRE结合，激活下游基因的转录表达。这种调控系统具有诱导表达特异性高、背景表达低、可调控性强等优点，被广泛应用于基因功能研究、基因治疗等领域。

杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，其宿主专一性为节肢动物。杆状病毒具有两种不同形态的病毒粒子，分别是出芽型病毒粒子（BV）和包埋型病毒粒子（ODV），在病毒的感染和传播过程中发挥着不同的作用。杆状病毒-昆虫细胞表达系统是一种常用的真核表达系统，具有表达水平高、能够进行蛋白质的翻译后修饰等优点，被广泛应用于重组蛋白的表达、疫苗研发等领域。

2A肽是一段短肽序列，通常由18-22个氨基酸组成。在翻译过程中，2A肽的C端与N端之间不会形成肽键，从而实现蛋白质的自我剪切。通过将2A肽序列插入到两个基因之间，可以使得翻译过程中蛋白质自动剪切，从而实现多个蛋白质的独立表达。目前常用的2A肽有P2A、T2A、E2A和F2A等，它们在剪切效率等方面存在一定差异。在构建多基因表达载体时，2A肽是一种常用的元件，能够有效实现多个基因的共表达。

PiggyBac（PB）转座子最初是在侵染昆虫细胞株的杆状病毒内首次分离得到的，属于真核生物的第二类转座子。PB转座子可以在基因组中切出和转座，切出和转座总是发生在特征性的TTAA四核苷酸目标位点序列，转座频率较高，而且受生物体种类的限制性较少。利用PB转座子构成的载体-辅助质粒系统已成功地在多种昆虫中实现了基因转移，如地中海果蝇、黑腹果蝇和家蚕等。在构建转基因昆虫时，PiggyBac转座子是一种重要的工具，能够将外源基因稳定地整合到昆虫基因组中。

1.2研究目的与意义

本研究旨在构建稳定表达Teton3G的Sf9细胞系及转基因粘虫品系。对于Sf9细胞系，通过稳定表达Teton3G，能够利用Tet-On3g调控系统精确控制外源基因在Sf9细胞中的表达，为研究基因功能、蛋白质表达与调控等提供稳定的细胞模型，有助于深入探究昆虫细胞的生物学特性和分子机制。在构建转基因粘虫品系方面，将Tet-On3g调控系统引入粘虫中，可实现对特定基因的时空特异性表达调控，为研究粘虫的生长发育、繁殖、行为等生物学过程提供有力的工具，也有助于揭示粘虫作为农业害虫的致害机制。

从更宏观的角度来看，本研究对于昆虫研究领域具有重要意义。稳定表达Teton3G的Sf9细胞系和转基因粘虫品系的成功构建，能够丰富昆虫细胞模型和转基因昆虫资源，为昆虫学研究提供新的手段和材料，推动昆虫分子生物学、发育生物学、生态学等多学科的发展。在农业害虫防治方面，深入了解粘虫等害虫的分子机理，有助于开发更加高效、绿色、可持续的害虫防治策略，减少化学农药的使用，降低对环境的污染，保障农业生产的安全和可持续发展。

二、材料与方法

2.1实验材料

实验用到的菌株为大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，用于质粒的转化与扩增。质粒包括pFastBacDual质粒、pXL-BacII质粒、pMD19-T（simple）质粒等，这些质粒作为基因克隆与表达的载体，承载着不同的基因元件，如启动子、目的基因等。细胞系选用Sf9细胞，它是从草地夜蛾蛹的卵巢组织得到的克隆细胞，具有半贴壁生长的特性，在昆虫杆状病毒表达系统中广泛应用，为后续的基因表达与细胞系构建提供基础细胞模型。

实验过程中使用的酶包括限制性内切酶（如BamHI、EcoRI、XhoI等）、T4DNA连接酶、DNA聚合酶等。限制性内切酶用于切割DNA片段，产生特定的粘性末端或平末端，以便进行基因片段的拼接；T4DNA连接酶则负责将不同的DNA片段连接起来，构建重组质粒；DNA聚合酶在PCR扩增等反应中发挥作用，用于合成D