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基于PEAR技术的修饰性寡核苷酸制备及其对大肠杆菌移码突变恢复的影响研究

一、引言

1.1研究背景与意义

在基因调控领域，寡核苷酸作为关键的分子工具，发挥着不可替代的作用。从基础的基因表达调控研究，到前沿的基因治疗应用，寡核苷酸都展现出巨大的潜力。在基因治疗中，反义寡核苷酸能够通过碱基互补配对与靶mRNA结合，阻止其翻译过程，从而实现对致病基因的沉默，为众多遗传性疾病和难治性疾病的治疗带来了新的希望。随着研究的不断深入，对寡核苷酸的需求在数量和质量上都呈现出爆发式增长，传统的制备方法逐渐暴露出诸多局限性。

目前，寡核苷酸的制备主要依赖化学合成法，如亚磷酰胺法。这种方法虽然能够合成特定序列的寡核苷酸，但其过程复杂繁琐，涉及多步化学反应和保护基团的引入与去除。每一步反应都存在一定的副反应和产率损失，随着寡核苷酸链长度的增加，错误累积效应愈发明显，导致最终产物的纯度和产率难以保证。化学合成过程中还需要使用大量有毒有害的有机溶剂和化学试剂，如四氢呋喃、二氯甲烷等，不仅对操作人员的健康构成威胁，还会对环境造成严重污染。此外，化学合成设备昂贵，运行和维护成本高，大规模生产的成本居高不下，这在很大程度上限制了寡核苷酸的广泛应用。

聚合酶-内切酶扩增反应（Polymerase-endonucleaseAmplificationReaction，PEAR）技术的出现，为寡核苷酸的制备带来了新的曙光。PEAR技术采用酶催化法，模拟病毒自我复制的机制，使寡核苷酸等小分子核酸能够在特定条件下实现自我复制和指数扩增。该技术具有诸多显著优势，首先，PEAR技术的产物纯度高，通过独特的“滑动-切割”机制，能够有效减少副产物的生成，经检测，其产物纯度可达100.0%，这为后续的研究和应用提供了极大的便利，无需复杂的纯化步骤即可直接使用。其次，PEAR技术的设备成本低，不需要昂贵的化学合成仪，仅需常规的酶促反应设备和热循环仪等，大大降低了生产门槛和成本，使得更多的研究机构和企业能够开展寡核苷酸的制备工作。再者，该技术无污染，反应过程在温和的条件下进行，不使用有毒有害的化学试剂，符合绿色化学和可持续发展的理念。PEAR技术的工艺易于放大，能够实现大规模生产，满足日益增长的寡核苷酸需求。

大肠杆菌作为一种模式生物，在生命科学研究中具有举足轻重的地位。其遗传背景清晰，生长繁殖迅速，易于培养和操作，是研究基因表达调控和遗传变异的理想模型。大肠杆菌移码突变是一种常见的基因突变类型，它会导致基因编码的蛋白质序列发生改变，从而影响蛋白质的结构和功能，进而引发一系列的生理变化和表型异常。探究大肠杆菌移码突变恢复机制，不仅有助于深入理解基因表达调控的基本原理，还为开发新型的基因治疗策略和药物提供了重要的理论依据。利用PEAR技术制备修饰性寡核苷酸，为研究大肠杆菌移码突变恢复提供了有力的工具。修饰性寡核苷酸能够特异性地与突变基因序列结合，通过碱基互补配对的方式修复移码突变，或者调节相关基因的表达，促进移码突变的恢复。这不仅为解决大肠杆菌移码突变相关问题提供了新的途径，还为拓展PEAR技术的应用领域奠定了基础，具有重要的科学意义和实际应用价值。

1.2国内外研究现状

在PEAR技术制备寡核苷酸方面，国内研究团队已取得了一系列具有创新性的成果。中国海洋大学的汪小龙等人首创了PEAR技术，该技术采用独特的双酶催化体系，通过热循环实现寡核苷酸的指数扩增。他们成功运用PEAR技术制备了硫代磷酸修饰和2-氟修饰的反义寡核苷酸，并利用电喷雾液相色谱-质谱联用技术（ESI/LC/MS）对产物进行了全面检测与分析，结果显示产物纯度高达100.0%。利用反向高效液相色谱（RP-HPLC）技术对PEAR产物的双链进行拆分和纯化，成功获得正义链和反义链。这一成果为修饰性寡核苷酸的大规模制备提供了新的有效方法，显著降低了生产成本，提高了生产效率，推动了寡核苷酸在基因治疗等领域的应用研究。

国外研究也在不断探索PEAR技术的优化与拓展应用。一些研究团队致力于改进PEAR技术的反应条件，通过调整酶的种类、浓度以及反应温度、时间等参数，进一步提高寡核苷酸的扩增效率和产物质量。在底物选择方面，研究人员尝试使用新型的核苷酸类似物作为底物，以拓展PEAR技术制备寡核苷酸的种类和功能。这些研究为PEAR技术的进一步发展提供了新的思路和方向。

在大肠杆菌移码突变恢复机制研究领域，国内外学者同样开展了广泛而深入的研究。国内有研究聚焦于大肠杆菌中与移码突变恢复相关的基因和蛋白质，通过基因敲除、过表达等实验手段，探究它们在移码突变恢复过程中的作用机制。研究发现某些基因的表达变化能够影响核糖体的翻译准确性，进而对移码突变的恢复产生影响。