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转基因人骨髓间充质干细胞：组织工程韧带种子细胞的新探索

一、引言

1.1研究背景与意义

韧带作为连接骨骼的重要结缔组织，对维持关节的稳定性和正常运动起着关键作用。然而，由于高强度运动、意外事故等因素，韧带损伤的发生率逐年上升。特别是严重创伤导致的大段韧带组织缺损，一直是修复重建外科领域面临的棘手难题。

目前，临床上针对韧带损伤主要采用韧带移植进行修复重建。其中，自体韧带移植是应用较为广泛的方法之一，但其存在供体部位功能缺损、手术时间长、创伤大以及移植后韧带疤痕愈合等问题，常常难以达到令人满意的临床效果。例如，在自体骨-髌腱-骨（BPTB）移植中，虽然该方法在ACL重建中应用较多且较为成功，但供区的髌腱被取走后，可能导致患者膝前疼痛、髌腱炎等并发症，严重影响患者术后的生活质量。同种异体移植物虽可避免供区受损并减少外科时间，但在灭菌和保存过程中抗张能力会降低，还存在传播疾病和引发对外来组织炎症反应的风险。合成材料的远期疗效欠佳，耐磨性和抗疲劳特性也有待进一步观察，目前临床应用相对较少。

组织工程韧带（Tissue-engineeredligament，TEL）作为一种新兴的治疗手段，为解决韧带损伤修复难题带来了新的希望。TEL是将种子细胞与具有韧带性能的支架材料复合而成，旨在体外构建出能够替代受损韧带的功能性组织。其具有诸多显著优点：首先，TEL是在体外利用支架和种子细胞构建而成，避免了再次取材给患者带来的痛苦，有效解决了自体移植物供区并发症的问题；其次，TEL可根据缺损情况进行塑形和构建，对于大段的韧带缺损，这种个性化的构建方式优势尤为突出；再者，TEL能够有效降低免疫反应及力学强度下降等问题，为患者提供更可靠的治疗效果。

在TEL的构建中，种子细胞的选择是至关重要的关键步骤，直接影响着组织工程韧带的性能和修复效果。理想的种子细胞应具备易于获取、增殖能力强、能够稳定表达韧带特异性细胞外基质等特点。骨髓间充质干细胞（Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）因其来源广泛，可通过骨髓穿刺轻松获得，并且在体外易于分离、纯化、培养和扩增，短期内就能获取构建TEL所需的细胞数量，成为了TEL种子细胞的研究热点之一。研究表明，BMSCs具有向多种组织细胞分化的潜能，在特定条件下，能够向韧带细胞方向分化。其中，采用碱性成纤维细胞生长因子（Basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）促进BMSCs向肌腱细胞分化的研究更是成为TEL种子细胞研究的热门方向。bFGF在韧带愈合过程中发挥着重要作用，它不仅可以促进韧带的愈合，还能诱导BMSCs向韧带细胞方向分化。

然而，局部应用重组细胞因子和生长因子存在代谢较快、价格较高以及局部免疫反应大等缺点。基因转染技术的出现为解决这些问题提供了新的途径。通过基因转染技术，将目的基因导入种子细胞，使其能够持续稳定地表达所需的生长因子，从而有效克服了传统方法的不足。本研究尝试利用腺病毒载体将bFGF及绿色荧光基因（Enhancedgreenfluorescentprotein，eGFP）转入人骨髓间充质干细胞（Humanbonemarrowmesenchymalstemcells，hBMSCs），并对bFGF的表达情况、转染后细胞的增殖、分化及产生韧带特异性细胞外基质的表达情况进行全面评价，旨在探索转基因hBMSCs作为组织工程韧带种子细胞的可行性和有效性，为临床治疗韧带损伤提供新的策略和方法，具有重要的理论意义和临床应用价值。

1.2国内外研究现状

在组织工程韧带种子细胞的研究方面，国内外学者进行了大量的探索。早期研究中，有学者将分离培养的兔ACL、内侧副韧带（MCL）、髌韧带、跟腱4种成纤维细胞分别种植于三维编织的聚乳酸（PLLA）ACL支架材料上，发现ACL细胞分泌I、III型胶原和纤连蛋白（FN）的基因表达水平高于其它3种成纤维细胞，认为ACL细胞作为组织工程ACL的种子细胞可能具有一定优势。但ACL细胞存在来源限制的问题，体外培养时细胞增殖较为缓慢。

骨髓基质干细胞（BMSc）因其具有向多种组织细胞分化的潜能，受到了广泛关注。GeZ、VanEijkF等对分离培养的ACL、MCL、皮肤成纤维细胞和BMSc进行比较研究，发现BMSc分泌细胞外基质（ECM）能力强、细胞增殖快。然而，韧带细胞表面没有特殊标记物，BMSc如何向韧带细胞诱导分化尚无统一认识。目前研究表明，在体外特定条件下，可应用机械应力、选择利用生长因子和骨形态发生蛋白12（BMP12）等诱导BMSc向韧带样细胞分化，但这些方