基因工程目的基因的获取优品文档.pptVIP

基因工程目的基因的获取;第四章目的基因的获取;第四章目的基因的获取;;;第一节基因组DNA片断化;第一节基因组DNA片断化;由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。;二、随机片断化;1）4bp的内切酶;2.机械切割法;第二节化学合成目的基因;第二节化学合成目的基因;①保护dNTP的5’端-OH或3’端P;研究某个基因，或者要克隆某个基因用于生产大量DNA和蛋白质分子,首先都要把它从庞大的基因组中分离出来。

在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。

f：fragment大小

~20Kb外源DNA片段

与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。

例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.

BAC:容量为300kb

内切酶Sau3A进行局部消化。

用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！

第二节化学合成目的基因

提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。

在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。;原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。;固相磷酸三酯合成过程;化学合成的DNA片断一般在200bp以内。;;2.互补延伸连接法;1.直接合成基因;化学合成法获取目的基因;DNA合成仪;第三节目的基因的保存和扩增;将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。

理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。;（2）目前常用的载体;断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。;（2）载体与基因组DNA大片段的连接;各种酶的接头可以向公司定做或购买。;;;酵母人工染色体基因组文库的构建;4.基因组文库的大小;例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104bp;1.cDNA;（1）不含内含子序列。

（2）可以在细菌中直接表达。

（3）包含了所有编码蛋白质的基因。

（4）比DNA文库小的多，容易构建。;4.构建cDNA文库的一般步骤;4.构建cDNA文库的一般步骤;分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。;OligodT纤维柱层析法;;反转录酶;用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。;;N:A、G、TorC

下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。

第三节目的基因的保存和扩增

在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。

载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。

不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。

N:A、G、TorC

酵母人工染色体基因组文库的构建

这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。

平均每44（256）bp一个切点。

与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。

酵母人工染色体基因组文库的构建

富集特定基因的mRNA或cDNA模板。

第三节目的基因的保存和扩增

N：所需的重组载体数（克隆数）

例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.;这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。;mRNA;在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。

或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。;;6.cDNA文库的大小;基因组DNA克隆cDNA克隆;三、文库的查询（screening）;第四节目的基因的分离和扩增;第四节目的基因的分离和扩增;纤

维

柱;2.mRNA消解杂交;从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。

将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。

不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。

用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。;A;3.mRNA差异显示PCR（DDRT-PCR）;（2）12种锚定引物;（3）5’端的随机引物;（4）随机引物与锚定引物成对扩增;（5）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较;二、PCR扩增获得目的基因;感谢观看