基因工程的载体和工具酶完整PPT.pptVIP

基因工程的载体和工具酶;引言;Characteristicsofvectorsforgenecloning;一、质粒载体

（plasimidvectors）;（一）质粒的生物学特性;（一）质粒的生物学特性;（一）质粒的生物学特性;（一）质粒的生物学特性;（一）质粒的生物学特性;（二）质粒DNA的制备;碱变性法质粒提取的原理：

根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。

在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。

通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。;碱变性法提取质粒的步骤：

1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；

2、加入100微升冰冷的溶液I，（50mM葡萄糖，25mMTris-HClPH=8.0,10mMEDTA）涡旋震荡悬浮菌液。

3、加入200微升新配制的溶液II，（0.2MNaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。

4、加入150毫升冰冷的溶液III，（醋酸钾29.4克，冰乙酸11.5毫升，加蒸馏水至100毫升）颠倒离心管10次后，冰浴5分钟。

5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。;（三）质粒载体的改造;1、质粒pBR322;pBR322质粒的优点：

（1）具有较小的分子量。

4363bp，2.6×106Da，

（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。

（3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。

（4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。;;2、pUC质粒载体;2、pUC质粒载体;?-互补(alpha-complementation)

大肠杆菌?-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的?-片段和?-片段分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶?-片段的LacZ’基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的?片段。这样一来，含有功能性完整的LacZ’基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的?-片段就能和寄主编码的?片段发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象被成为是alpha-complementation.

X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷;;二、噬菌体载体

（phagevectors）;1.噬菌体的生物学特性;1.噬菌体的生物学特性;2.?噬菌体的生物学特性;2.?噬菌体的生物学特性;2.?噬菌体的生物学特性;;①Insertionvectors;②Replacementvectors;（二）M13噬菌体;;2.M13噬菌体载体的构建;（三）柯斯质粒载体（cosmidvectors）;（三）柯斯质粒载体（cosmidvectors）;（三）柯斯质粒载体（cosmidvectors）;;第二节基因操作的工具酶;（一）限制性核酸内切酶的发现

（二）限制性核酸内切酶的分类

（三）限制性核酸内切酶的命名

（四）II型限制性核酸内切酶的基本特性

（五）限制性核酸内切酶的消化反应;⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。

5’TTTTTTTTT

3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’

是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。

2、加入100微升冰冷的溶液I，（50mM葡萄糖，25mMTris-HClPH=8.

这是该噬菌体能用于单链DNA载体的重要前提。

（2）四环素抗性基因（tetr或Tcr）

利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。

碱变性法质粒提取的原理：

⑶cDNA克隆中第二链cDNA的合成

3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’

（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数;E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶

当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。;;最早分离出的限制内切酶—1968年，Mes