荧光免疫技术.pptVIP

荧光免疫技术彭晓东概念荧光免疫技术（fluoroimmunoassay）将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法。特点直观定位性快速、敏感传统荧光抗体技术的基本原理光源荧光素-Ab+Ag荧光素-Ab-Ag荧光显微镜观察荧光的基础知识

荧光抗体的制备

免疫荧光显微技术

在医学检验中的应用

荧光的基础知识荧光某些物质受到一定波长光激发后，在极短时间内发射出波长大于激发光波长的光。荧光产生机制吸收并储存能量一些化学物质基态激发态发光发射光谱指固定激发光波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的强度。激发光谱指固定检测波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。荧光效率发射荧光的光量子数(荧光强度)荧光效率=吸收光的光量子数(激发光强度)荧光寿命指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。荧光的猝灭指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会发生减弱的现象。荧光偏振FH-FLP=FH+FLP=0说明完全不偏振，-1P1为部分偏振荧光物质其他荧光物质镧系螯合物如Eu3+等酶作用后产生荧光的物质如:4甲基伞酮-β-D半乳糖苷β-半乳糖苷酶4甲基伞酮荧光免疫分析常用的仪器和设备荧光显微镜荧光分光光度计流式细胞仪荧光显微镜光源高压汞灯、氙灯或卤素灯紫外光（UV系统，UG）兰紫光（BV系统，BG）透射光落射光滤板隔热滤板：能阻断红外线的透过而隔热。激发滤板：提供合适的激发光谱。BG只允许325~500nm波段通过，最大透光度在410nm。吸收滤板：滤除激发光而只允许荧光通过。透光范围410~650nm，有OG(橙黄色)和GG(淡绿黄色)两种。荧光抗体的制备荧光抗体荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成。荧光抗体的制备一、抗体与荧光素的结合二、标记抗体的纯化三、荧光抗体的鉴定一、抗体与荧光素的结合对抗体的要求：1用于标记的抗体，是高特异性和高亲和力的；2所用抗血清中不应含有针对标本中正常组织的抗体；3一般需经纯化提取IgG后再作标记。作为标记的荧光素应符合以下要求1具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。2荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持高的荧光效率。3荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。4与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质，与蛋白质的结合物稳定，易于保存。5标记方法简单、安全无毒。抗体标记荧光素常用方法1.