基因工程载体构建蛋白表达优品文档.pptVIP

基因工程载体构建蛋白表达;载体构建与蛋白表达;真核细胞与原核细胞的比较;原核细胞与真核细胞的区别;原核表达与真核表达的区别;乳糖操纵子学说(原核基因的表达调控);真核细胞的复制、转录、翻译;mRNA剪切;利用受体菌蛋白的特异性抗体、配体或底物亲和层析等技术，较容易地分离融合蛋白，然后通过蛋白酶水解，特异性裂解外源目的蛋白与受体菌蛋白之间的肽键，最终得到外源目的蛋白。

信号肽N端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部氨基酸为疏水性氨基酸。

分泌信号序列引导分泌蛋白从胞内到胞外，并对蛋白质翻译后加工起作用。

ThepromoterofAOX1canbeactivatedstronglybycarbinal.

据悉UAAU为有效终止密码子。

（一）高效表达外源基因的基本策略

表达中等外源蛋白。

DNA复制及重组载体的选择系统

巴斯德毕赤酵母表达系统的优点

真核细胞与原核细胞的比较

外源基因的高表达产物在原核细胞中积累，并致密地聚集在一起形成的一种不溶性蛋白质结构。

34%YNB,4×10-5生物素，2%葡萄糖，1.

组成型启动子：T7噬菌体启动子

无有（MT、MF、IF）

每个表达单元都含有独立的启动子、终止子、SD序列、起始密码和终止密码。

二、常见的原核细胞表达载体系统

待整合的外源基因两侧必须带一段与染色体完全同源的的序列。;一、原核基因表达载体的构成

DNA复制及重组载体的选择系统

复制子:扩增

选择标记：筛选

外源基因的转录系统

启动子

抑制物基因

转录终止子

蛋白质的翻译系统

核糖体结合位点

翻译起始密码子

翻译终止密码子

;;pBR322

old-style

generalpurposeplasmid;

DNA复制及重组载体的选择系统

复制子：包含复制起始位点（ori)和有关序列在内的DNA片段。

常见复制子有pMB1,p15A,ColE1和pSC101等。

前3者为松弛复制型，含pSC101复制子的质粒载体严谨复制型。

选择标记：抗生素抗性基因

;

外源基因的转录系统

启动子:能被宿主RNA聚合酶特异识别和结合并指导目的基因转录的DNA序列。启动子具有序列特异性、启动的方向性、作用的位置特性和种属特异性。

诱导型启动子：Lac、Trp、Tac等

组成型启动子：T7噬菌体启动子

抑制物基因:其产物是控制启动子功能的蛋白质，对启动子的起始转录功能产生抑制作用。适当的诱导条件可使拟制物失活，启动子功能恢复。

转录终止子：终止RNA聚合酶转录的DNA序列。

本正终止子：不需要其他蛋白辅助因子，

依赖终止信号的终止子：依赖专一蛋白辅助因子（如ρ因子）

防止转录过头

;3）蛋白质的翻译系统

影响翻译起始的因素：起始密码子、核糖体结合位点(SD序列)、起始密码与SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5’端非翻译序列和蛋白编码区的5’端序列

核糖体结合位点

翻译起始密码子

翻译终止密码子

;核糖体结合位点：原核生物转录起始位点(RBS)下游的一段DNA序列，由SD序列和起始密码子组成。SD序列大约3-9bp,位于ATG上游3-11bp处。SD序列可与核糖体16SrRNA特异配对而与宿主核糖体结合。大肠杆菌SD序列为5’AGGAGG3’，其中GGAG4碱基发生任何改变均大幅度降低翻译效率。

;翻译起始密码子：一般为ATG(AUG),编码甲硫氨酸(Met),也有采用其他密码子。

影响翻译效率的因素有：SD序列、翻译起始密码子、SD序列和翻译起始密码子之间的距离和碱基组成等。据报道，SD序列后面为AAAA或UUUU时，翻译起始效率最高，而当为CCCC或GGGG时效率最低。

;翻译终止密码子：它核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模板上脱落，终止翻译过程。大肠杆菌中多肽链的释放由释放因子RF1和RF2调控。RF1识别UAA和UAG,RF2识别UAA和UGA，故选UAA作终止密码子。可将几个终止密码子串联。据悉UAAU为有效终止密码子。

;二、常见的原核细胞表达载体系统;三、外源基因在原核细胞中的表达形式;（一）包涵体;（二）融合蛋白;融合蛋白的特点;融合蛋白的特点;（三）寡聚型的外源蛋白…多个外源蛋白基因串联;多表达单元的重组：

每个表达单元都含有独立的启动子、终止子、SD序列、起始密码和终止密码。

表达分子量较大的蛋白，

不需要裂解处理。启动子相互竞争

;多顺反子重组：

多拷贝的外源基因有各自的SD序