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免疫学抗体实验操作流程指南

一、概述

免疫学抗体实验是研究抗体结构、功能及其与抗原相互作用的重要技术手段。本指南旨在提供一套标准化的实验操作流程，确保实验结果的准确性和可重复性。实验流程涵盖抗体制备、纯化、表征及应用等关键环节，适用于科研及工业领域。操作前需熟悉相关试剂、仪器及安全规范，并严格按照步骤执行。

二、实验准备

（一）试剂与材料

1.抗体溶液：根据实验需求配置浓度（1-10mg/mL）。

2.抗原：纯化抗原或重组抗原，纯度需≥95%。

3.纯化介质：蛋白A/G亲和层析填料、离子交换树脂等。

4.缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS）、Tris缓冲液等，pH7.4-7.6。

5.其他：NaN?（终浓度0.02%）、BSA（封闭用）、吐温20（辅助溶解）。

（二）仪器设备

1.超纯水仪：用于制备超纯水。

2.离心机：4℃高速冷冻离心机。

3.层析柱：玻璃或塑料层析柱（直径1-2cm，床体积5-10mL）。

4.分光光度计：测定抗体浓度（如NanoDrop）。

5.蛋白质电泳系统：SDS或WesternBlot设备。

（三）安全防护

1.佩戴实验手套、护目镜及实验服。

2.操作生物试剂需在生物安全柜中进行。

3.化学试剂需避免直接接触皮肤，若接触立即用大量水冲洗。

三、抗体纯化

（一）亲和层析纯化

1.**步骤1：平衡层析柱**

-用5-10倍床体积的平衡缓冲液（含NaN?）流过层析柱，平衡至基线稳定。

2.**步骤2：上样**

-将抗体粗提液（浓度≤5mg/mL）缓慢上样，流速≤0.5mL/min。

3.**步骤3：洗脱**

-用低盐缓冲液（含0.5-1M盐）进行线性梯度洗脱，收集目标峰（通常在200-500mL范围内）。

4.**步骤4：浓缩与透析**

-将洗脱液通过超滤管（截留分子量3kDa），浓缩至原体积的1/5-1/10。

-用10倍体积的置换缓冲液（无盐）透析过夜，更换缓冲液2-3次。

（二）离子交换层析（备选）

1.**步骤1：柱平衡**

-用低盐缓冲液平衡层析柱，监测电阻率确保一致性。

2.**步骤2：上样与洗脱**

-上样后用线性盐梯度（pH6-8范围内）洗脱，收集单一主峰。

3.**步骤3：再生**

-用高盐缓冲液（1MNaCl）冲洗柱子，然后用低盐缓冲液重新平衡。

四、抗体表征

（一）SDS电泳

1.配制样品缓冲液（含β-巯基乙醇），混合抗体样品（5-10μL）及缓冲液。

2.上样至预电泳胶（12-15%），100V电泳1-2小时。

3.联合染色（考马斯亮蓝或银染），分析纯度（纯度≥90%为合格）。

（二）WesternBlot验证

1.**步骤1：转膜**

-电泳后用半干或湿转法将蛋白转移至PVDF膜（30-60min）。

2.**步骤2：封闭**

-用5%脱脂奶粉/TBS-T缓冲液封闭1-2小时，室温避光。

3.**步骤3：孵育一抗**

-用稀释后的一抗（1:500-1:1000，TBS-T/0.1%BSA）孵育4小时或过夜。

4.**步骤4：孵育二抗**

-用HRP标记的二抗（1:2000-1:5000）孵育1小时，TBS-T洗3次。

5.**步骤5：化学发光检测**

-加入ECL底物，用成像系统曝光（曝光时间5-20秒）。

五、注意事项

1.所有操作需在无菌条件下进行，避免污染。

2.抗体浓度过高可能导致沉淀，需适当稀释后上样。

3.每次实验需设置阴性对照（无抗体的孵育步骤）。

4.纯化后的抗体建议分装后-80℃储存，长期保存可添加甘氨酸。

六、结果分析

1.**纯度评估**：SDS主带单一，无杂带为合格。

2.**活性验证**：WesternBlot信号强度与抗体浓度成正比。

3.**数据记录**：记录抗体产量（mg/mL）、纯化回收率（≥70%为合格）及储存稳定性（至少6个月活性无显著下降）。

一、概述

免疫学抗体实验是研究抗体结构、功能及其与抗原相互作用的重要技术手段。本指南旨在提供一套标准化的实验操作流程，确保实验结果的准确性和可重复性。实验流程涵盖抗体制备、纯化、表征及应用等关键环节，适用于科研及工业领域。操作前需熟悉相关试剂、材料、仪器及安全规范，并严格按照步骤执行。熟悉这些流程有助于提高实验效率，减少误差，并为后续的免疫学应用奠定坚实基础。

二、实验准备

（一）试剂与材料

1.抗体溶液：根据实验需求配置浓度（通常为1-10mg/mL）。若为细胞培养上清液制备的抗体，需先离心（4000rpm,10min,4℃）去除细胞碎片。若为血清制备，需先56℃水浴灭活30分钟。

2.抗原：纯化抗原或重组抗原，纯度需≥95%。可采用Ni-NTA纯化His标签蛋