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免疫学实验技术流程

###一、免疫学实验技术概述

免疫学实验技术是研究免疫应答机制、抗体特性、细胞功能等的重要手段。通过一系列标准化的操作流程，可以准确检测和分析免疫相关分子及细胞。本流程涵盖样本准备、试剂配制、实验操作及结果分析等关键环节，确保实验结果的可靠性和可重复性。

###二、实验准备与样本处理

####（一）实验材料与试剂准备

1.**主要试剂**：

-免疫佐剂（如弗氏不完全佐剂或完全佐剂）

-抗体（单克隆或多克隆，根据实验需求选择）

-补体（如豚鼠补体或羊抗鼠IgG补体）

-酶标记抗体（如HRP或AP标记的抗体）

-终止液（如2MH?SO?或氢氧化钠溶液）

-标记底物（如TMB或OPD）

2.**其他材料**：

-96孔酶标板或ELISA板

-移液器及吸头（不同量程）

-微波炉或水浴锅

-酶标仪

####（二）样本采集与处理

1.**样本类型**：

-血清/血浆

-组织匀浆液

-细胞培养上清

-唾液或尿液

2.**处理步骤**：

(1)**血清/血浆制备**：

-静脉采血，室温静置30分钟，3000rpm离心10分钟，取上清。

--20℃保存备用。

(2)**组织匀浆**：

-组织用PBS清洗，剪成小块，加入匀浆缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上匀浆。

-12000rpm离心15分钟，取上清。

(3)**细胞培养上清**：

-收集24-48小时细胞培养液，4000rpm离心5分钟，取上清。

###三、实验操作流程

####（一）ELISA（酶联免疫吸附测定）

1.**包被**：

(1)将抗体（如捕获抗体）用包被液稀释至0.1-1.0μg/mL。

(2)100μL/孔加入ELISA板，4℃过夜包被。

(3)用PBST（含0.05%Tween-20）洗涤3次，每次5分钟。

2.**封闭**：

(1)加入封闭液（如5%BSA或脱脂奶粉），37℃封闭1-2小时。

(2)PBST洗涤3次。

3.**孵育检测抗体**：

(1)加入稀释后的检测抗体（如一抗），37℃孵育1小时。

(2)PBST洗涤3次。

4.**孵育酶标抗体**：

(1)加入HRP或AP标记的二抗，37℃孵育1小时。

(2)PBST洗涤3次。

5.**显色**：

(1)加入TMB或OPD底物，避光反应15-30分钟（可根据酶标仪信号调整）。

(2)加入终止液，酶标仪检测吸光度值（OD450或OD405）。

6.**结果计算**：

-计算样品OD值与标准品曲线的浓度对应关系。

####（二）WesternBlot（蛋白质印迹）

1.**样品制备**：

(1)细胞或组织裂解，BCA法测定蛋白浓度。

(2)样品加入还原剂（如β-巯基乙醇）和上样缓冲液，煮沸5分钟。

2.**SDS电泳**：

(1)配制12-15%SDS凝胶，样品上样，100V电泳2-3小时。

(2)电泳结束后，将蛋白转移至PVDF或NC膜。

3.**封闭与孵育**：

(1)膜用TBST洗涤，5%BSA封闭1小时。

(2)孵育一抗（1:1000稀释），4℃过夜。

(3)TBST洗涤3次，孵育HRP标记的二抗（1:5000稀释），37℃1小时。

4.**化学发光检测**：

(1)加入ECL底物，使用化学发光成像系统拍照。

(2)使用软件分析条带灰度值。

####（三）流式细胞术（FlowCytometry）

1.**细胞制备**：

(1)常规细胞培养，胰酶消化，PBS重悬。

(2)1000rpm离心5分钟，弃上清。

2.**染色**：

(1)加入固定液，4℃固定30分钟。

(2)PBS洗涤，加入破膜剂，室温孵育15分钟。

(3)孵育荧光标记抗体（如CD3-PE，CD4-FITC），4℃避光30分钟。

3.**上机检测**：

(1)PBS洗涤，重悬细胞，上流式细胞仪检测。

(2)设定门控区域，分析细胞亚群比例及细胞功能。

###四、数据处理与结果分析

1.**数据分析软件**：

-ELISA：GraphPadPrism或Excel拟合标准曲线。

-WesternBlot：ImageJ或QuantityOne分析条带灰度。

-流式细胞术：FlowJo或FCSExpress进行细胞分群分析。

2.**结果解读**：

-结合实验目的，分析抗体结合强度、蛋白表达水平或细胞亚群变化。

-注意对照组设置（如阴性对照、空白对照）以排除干扰。

###五、注意事项

1.**无菌操作**：所有实验需在洁净台进行，避免污染。

2.**酶标仪校准**：定期校准吸光度检测，确保结果准确。

3.**抗体存储**：抗体需-20℃保存，