培养细胞的观察和检测方法课件(1).pptVIP

;培养细胞的观察

检测方法;;一、活细胞的观察检测方法;;肉眼观察;显微镜观察;相差显微镜观察活细胞的步骤如下：;;生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。

若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。;BMSCs;;各种细胞及各代细胞增殖的时间不尽相同。

原代细胞、成体组织的潜伏期较长，24h后仅见到部分细胞开始贴壁，9～12d长满瓶底，细胞融合呈交叉重叠生长。

传代细胞系、胚胎组织或幼体细胞潜伏期短，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期、对数生长期，细胞大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。

一旦发现细胞长满瓶底80％就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至脱落。

悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、培养液变黄时也应及时传代。;Anip973;注意事项;;活细胞的观察检测方法;暗视野显微镜技术观察活细胞

（darkfieldmicroscope)

原理：利用特殊聚光器使光线不能进入物镜，经过标本的散射光线使物镜被放大，因此在黑暗背景中可呈现明亮的像。

优点：反差增大，分辨率提高，可观察到5nm的微小质点。

应用：观察活细胞内的细胞核、线粒体、细菌和霉菌等。

缩时显微摄影术观察

（time-lapsecinemicrophotagraphy，TLCM）

优点：可直接记录活细胞的连续动态变化过程，能非常直观地展现细胞生长过程中的动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜变化、细胞死亡等过程。

缺点：较昂贵;体外活细胞染色观察;中性红染色

常用活体染料，一般浓度为1：10000，用生理盐水（或Hanks液）溶解后进行高压蒸汽灭菌暗处存放，可直接浸染活体细胞显微镜下观察或用于细胞的病毒蚀斑，肉眼计数空斑数目。因其毒性大，染色后细胞不能再培养。

结晶紫染色

使用浓度为0.1％，可用生理盐水配制，室温保存。该染料对死、活细胞均着色，故只能测出细胞总数。

台盼蓝染色

用0.5％浓度的台盼蓝（trypanblue)，用PBS配制???室温保存，该染料只对死细胞着色，可测定活细胞数和计算存活百分率。

;;;;二、培养细胞常用的染色方法;1、细胞固定的基本方法;;;常用固定液;2、细胞常用的染色方法;;Giemsa（吉姆萨）染色法;;;3、细胞特殊的染色方法;Feulgen（福尔根）染色法;;考马斯亮蓝（Coomassie，BB）染色法;;过碘酸席夫反应法

（periodicacidSchiffreaction，PAS）;;细胞内脂类的染色方法;;;油红O（oilredO）法;;免疫荧光染色法

原理：将已知抗体或抗原标记荧光素，用此特异性试剂，浸染含有相应抗原或抗体的组织细胞标本，借助抗原抗体的特异性结合，于抗原或抗体的存在部位呈现荧光，从而可以定位标本内的抗原或抗体。

免疫酶染色法

原理：ABC免疫酶染色法即卵白素-生物素-酶复合物法，是目前最敏感的免疫细胞化学染色法之一。其基本原理是将特异性第一抗体与组织细胞相应抗原结合后，通过生物素化桥抗体与第一抗体结合，借助卵白素与生物素的天然亲和性将生物素化辣根过氧化酶连接为复合物，通过酶促反应，显示组织细胞相应的抗原。;;三、细胞生长状况有关指标的检测方法;1、细胞计数法;;;;结果分析

细胞密度

细胞数/ml＝（4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数

细胞存活百分率

细胞活力（％）＝未着色细胞数÷总细胞数×100％;2、细胞生长曲线;3、细胞分裂指数;4、克隆形成率;;四、细胞生物活性的化学检测法;1、四氮唑盐（MTT）比色法;;2、细胞蛋白质含量测定法

（考马斯亮蓝测定法）;3、细胞蛋白质

合成的3H-亮氨酸掺入试验;4、细胞DNA合成的3H-TdR

掺入试验;五、电子显微镜技术;;;;