基因敲除技术原理.pptxVIP

演讲人：日期:基因敲除技术原理

CATALOGUE目录01技术概述02分子机制03关键工具系统04操作流程步骤05验证与分析06应用与前沿

01技术概述

基本原理定义同源重组机制基因功能缺失模型构建胚胎干细胞（ES细胞）的应用基因敲除利用DNA片段的同源序列与靶基因进行特异性重组，通过外源载体将设计好的同源臂导入细胞，实现目标基因的定向失活或替换。ES细胞具有全能分化潜能，可作为基因编辑的受体细胞，通过体外培养和筛选获得稳定遗传修饰的细胞系。通过敲除特定基因，观察生物体表型变化，反向推导该基因在生理或病理过程中的功能角色。

发展历程背景20世纪80年代技术萌芽基因同源重组理论的确立为基因敲除提供了理论基础，MarioCapecchi等科学家首次在小鼠胚胎干细胞中实现定向基因修饰。1990年代技术成熟ES细胞培养体系优化和筛选标记（如新霉素抗性基因）的应用，显著提高了基因敲除的成功率和效率。21世纪技术革新CRISPR-Cas9等新型基因编辑工具的出现，补充了传统基因敲除技术，但同源重组仍是复杂模型构建的金标准。

核心目标与意义基因功能解析通过敲除特定基因并观察表型变化，明确基因在发育、代谢或疾病中的具体作用机制。生物医学应用推动基因治疗和靶向药物开发，例如通过敲除免疫检查点基因增强癌症免疫疗法的效果。疾病模型构建模拟人类遗传性疾病（如囊性纤维化、阿尔茨海默病）的动物模型，为病理研究和药物筛选提供实验基础。

02分子机制

DNA双链断裂过程CRISPR-Cas9或TALENs等基因编辑工具通过特异性识别靶序列，在目标基因位点诱导DNA双链断裂（DSB），形成断裂末端。核酸酶介导的切割断裂位点的结构特征细胞应激响应断裂后的DNA末端可能呈现平末端或黏性末端，其化学修饰（如磷酸化）会影响后续修复途径的选择。DSB触发细胞DNA损伤应答（DDR）通路，激活ATM/ATR激酶等信号分子，启动修复机制以维持基因组稳定性。

修复机制类型区分同源重组修复（HDR）依赖同源模板（如外源供体DNA）进行精确修复，适用于基因敲入或定点修饰，但效率受细胞周期（S/G2期为主）限制。非同源末端连接（NHEJ）微同源介导的末端连接（MMEJ）无需模板直接连接断裂末端，易引入插入或缺失突变（Indels），是基因敲除的主要修复途径，但可能导致移码突变或功能丧失。利用短同源序列（2-25bp）介导修复，介于HDR与NHEJ之间，常产生较大片段缺失，需通过测序验证修复结果。123

敲除效率影响因素sgRNA设计优化CRISPR系统中单导RNA（sgRNA）的靶向特异性、GC含量及二级结构影响Cas9结合效率，需通过算法预测并筛选高活性sgRNA。细胞类型与状态分裂活跃的细胞（如胚胎干细胞）更易发生HDR，而终末分化细胞（如神经元）依赖NHEJ；转染效率、核膜完整性等也影响递送效果。修复通路调控抑制NHEJ关键因子（如Ku70/80）或过表达HDR相关蛋白（如Rad51）可定向调控修复途径，需结合小分子抑制剂或基因编辑工具协同优化。

03关键工具系统

CRISPR/Cas9技术靶向识别机制CRISPR/Cas9系统通过向导RNA（gRNA）与目标DNA序列的互补配对实现精准定位，Cas9蛋白在PAM序列（NGG）附近诱导DNA双链断裂（DSB），触发细胞修复机制。应用场景扩展除基因敲除外，通过突变Cas9蛋白（如dCas9）可开发为基因激活/抑制工具，或结合荧光标记实现基因组成像，广泛应用于疾病模型构建和基因治疗。高效性与多基因编辑该系统可同时设计多个gRNA靶向不同基因位点，实现高通量基因敲除或敲入，效率高达80%以上，适用于复杂遗传网络研究。

TALENs由转录激活因子样效应物（TALE）阵列与FokI核酸酶组成，每个TALE重复单元可特异性识别单个碱基（如NI=A,HD=C,NG=T,NN=G），通过模块组合实现任意序列靶向。TALENs技术模块化DNA识别结构TALENs的DNA结合域较长（通常14-20bp），结合FokI二聚化切割机制，显著降低非特异性切割风险，适用于对精度要求高的临床研究。高特异性与低脱靶效应在大型动物模型（如猪、猴）中成功实现多基因敲除，尤其在异种器官移植和遗传病治疗领域展现优势，但构建周期长、成本较高。复杂基因编辑应用

ZFNs技术锌指蛋白识别原理特定场景优势早期基因组编辑工具ZFNs利用锌指蛋白（ZFP）结构域（每个识别3bp）串联组合成DNA结合模块，与FokI核酸酶融合后形成二聚体切割靶点，需设计配对ZFN以保障切割效率。作为第一代人工核酸酶，ZFNs在2000年代初率先实现哺乳动物细胞基因定向修饰，但受限于锌指模块间的协同效应，靶点设计灵活性较低。在短片段精确插入（如CCR5基因编辑治疗艾滋病）中仍具价值，但逐