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免疫学操作规程总结

###一、免疫学操作规程概述

免疫学操作规程是指在免疫学研究和实验过程中，为确保实验结果的准确性、可重复性及操作人员的安全而制定的一系列标准化流程。本总结涵盖免疫学常用技术的基本操作步骤、关键注意事项及质量控制要点，适用于实验室工作人员的日常操作参考。

###二、免疫学基本操作规程

####（一）抗体制备与纯化

1.**抗体制备**

(1)**多克隆抗体制备**

-**免疫原制备**：根据目标抗原设计合成肽段或表达重组蛋白，纯化后用于免疫动物。

-**动物免疫**：选择合适的小鼠或兔子，分阶段进行免疫（如首免、加强免疫），采集血清检测效价。

-**血清纯化**：采用蛋白A/G亲和层析柱纯化抗体，检测纯度（如SDS、WesternBlot）。

(2)**单克隆抗体制备**

-**杂交瘤细胞构建**：融合B细胞与骨髓瘤细胞，筛选阳性克隆（如HAT培养基筛选）。

-**腹水或细胞培养上清采集**：纯化抗体（如蛋白A柱纯化），检测特异性（ELISA、WesternBlot）。

2.**抗体纯化**

-**层析技术**：常用离子交换层析、凝胶过滤层析或亲和层析纯化抗体。

-**质量检测**：纯度（95%）、活性（特异性结合实验）、内毒素（1EU/mL）。

####（二）ELISA检测技术

1.**间接ELISA操作**

(1)**包被**：用稀释后的抗原包被酶标板，4℃过夜。

(2)**封闭**：用封闭液（如5%脱脂奶粉）封闭非特异性位点，37℃1小时。

(3)**加样**：加入稀释后的二抗（或生物素化抗体），37℃1小时。

(4)**显色**：加入TMB底物，避光反应30分钟，酶标仪检测OD值（450nm）。

2.**注意事项**

-抗体稀释比例需优化（如1:1000~1:5000）。

-避免交叉反应，可使用交叉反应性测试抗体验证。

####（三）WesternBlotting技术

1.**操作步骤**

(1)**蛋白提取与变性**：细胞裂解液提取蛋白，加入β-巯基乙醇，100℃变性5分钟。

(2)**SDS电泳**：上样20-50μg蛋白，120V电泳2-3小时。

(3)**转膜**：电转移至PVDF或NC膜，甲醇预湿润10分钟。

(4)**封闭**：5%脱脂奶粉封闭1小时，TBS-T洗膜3次。

(5)**孵育一抗**：1:1000稀释抗体，4℃过夜，TBS-T洗膜3次。

(6)**孵育二抗**：1:5000稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃1小时，TBS-T洗膜3次。

(7)**化学发光**：加入ECL底物，化学发光成像系统检测（曝光时间5-10分钟）。

2.**关键控制点**

-电泳时电压和时间需标准化，避免条带弥散。

-转膜后用PVDF膜封闭前需甲醇激活（30秒）。

####（四）流式细胞术操作

1.**细胞制备**

(1)**细胞收集**：用胰蛋白酶消化贴壁细胞，离心收集。

(2)**固定与permeabilization**：用固定液（如4%多聚甲醛）固定，PBS洗后用透化剂（如0.1%TritonX-100）处理。

2.**染色步骤**

(1)**表面染色**：冰上孵育荧光标记抗体（如CD3-PE），避光30分钟。

(2)**胞内染色**：用破膜剂裂解细胞，加入胞内抗体（如磷酸化信号通路抗体），避光30分钟。

3.**上机检测**

-设定门控区域，检测细胞数量（如10000个细胞）及荧光强度。

-使用标准品（如同型对照抗体）校正荧光偏差。

###三、免疫学实验安全与质量控制

1.**安全操作**

-操作生物试剂需佩戴手套、护目镜，并在生物安全柜内进行。

-化学试剂（如过氧化物酶）需避光保存，避免接触皮肤。

2.**质量控制**

-每个实验需设置阴性对照（如未包被板孔）、阳性对照（已知阳性样本）。

-定期校准仪器（如酶标仪、流式细胞仪），确保读数准确。

3.**数据记录**

-实验参数（如抗体浓度、孵育时间）需详细记录，确保可重复性。

###四、总结

免疫学操作规程的规范化执行是保证实验结果可靠性的基础。本总结涵盖了抗体制备、ELISA、WesternBlot及流式细胞术的核心步骤，通过标准化操作可减少误差，提升实验效率。实验室人员应严格遵循规程，并持续优化实验条件，以获得高质量数据。

###二、免疫学基本操作规程（续）

####（一）抗体制备与纯化（续）

1.**抗体制备**

(1)**多克隆抗体制备**

-**免疫原制备**

-**抗原设计**：根据目标蛋白的氨基酸序列，选择包含主要表位的合成肽段（如15-20个氨基酸，重叠度30%）。或表达重组蛋白，通过N