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双水相萃取胰岛素前体：复性与分离新工艺的探索与实践

一、引言

1.1研究背景与意义

糖尿病作为一种常见的慢性代谢性疾病，严重威胁着人类的健康。国际糖尿病联盟（IDF）发布的报告显示，全球糖尿病患者数量持续攀升，截至目前，患病人数已达数亿之多。胰岛素作为治疗糖尿病的关键药物，其需求量也随之急剧增长。据相关市场调研机构预测，未来几年胰岛素市场规模将以可观的速度扩张。

在胰岛素的生产过程中，胰岛素前体的复性与分离是极为关键的环节。传统的胰岛素前体复性方法主要采用稀释变性剂的方式。然而，这种方法存在诸多弊端，在工业生产中，需要消耗大量的尿素，不仅增加了生产成本，还对环境造成了较大压力；复性液在后续纯化前还需进行浓缩，这导致工作体积大，需要配备大型的设备，从而增加了设备投资成本；同时，大量的废水产生也给废水处理带来了沉重的负担，不符合当下绿色环保、可持续发展的理念。因此，开发一种高效、环保、经济的新工艺来替代传统方法，对于提高胰岛素的生产效率、降低生产成本、减少环境污染具有至关重要的意义，这也成为了当前胰岛素生产领域亟待解决的关键问题。

双水相萃取技术作为一种新型的分离技术，在蛋白纯化方面展现出了独特的优势，为胰岛素前体复性分离提供了新的思路和方法。将双水相萃取技术应用于胰岛素前体复性分离，有望打破传统方法的局限，实现胰岛素生产工艺的革新，提高胰岛素的质量和产量，满足日益增长的市场需求，具有重要的现实意义和广阔的应用前景。

1.2双水相萃取技术概述

双水相萃取（Aqueoustwophaseextraction，简称ATPE）是一种基于物质在两相间选择性分配的萃取技术。该技术最早于1896年由Beijerinck发现，当时他观察到明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液混合时，会形成混浊不透明的溶液并分成两相，这一现象被称为聚合物的不相溶性，由此产生的双水相体系（Aqueoustwophasesystem,ATPS）成为了后来双水相萃取技术的基础。

其基本原理是利用物质在双水相体系中的分布差异来实现分离。当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在以及环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。物质在双水相体系中分配系数K可用公式K=\frac{C_{上}}{C_{下}}表示，其中K为分配系数，C_{上}和C_{下}分别为被分离物质在上、下相的浓度。分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，便可利用双水相萃取体系对物质进行分离，其分配情况服从分配定律，即在一定温度一定压强下，如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于常数。

双水相萃取技术具有众多独特优势：首先，其含水量高达70%-90%，可在接近生理环境的体系中进行萃取，这一特性使得生物活性物质在萃取过程中不易失活或变性；能够直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需蛋白质（或酶），甚至无需破碎细胞就能提取细胞内酶，大大简化了工艺流程；自然分相时间通常较短，一般为5分钟至15分钟，提高了分离效率；界面张力极小，仅为10^{-7}~10^{-4}mN/m，有利于两相之间的质量传递，界面与试管壁形成的接触角近似直角；该技术不使用挥发性有机溶剂，高聚物通常是不可挥发物质，对人体无害，减少了对环境的污染；在萃取过程中，大量杂质可随固体物质一起去除，提高了目标产物的纯度；易于进行工艺放大和连续操作，能与后续提纯工序无缝衔接，无需特别处理；并且可在常温常压下操作，条件温和，避免了高温、高压等极端条件对生物活性物质的破坏。鉴于这些优势，双水相萃取技术在生物化学、细胞生物学、生物化工和食品化工等多个领域得到了广泛的应用，如蛋白质、酶、病毒、脊髓病毒和线病毒的纯化，核酸、DNA的分离，干扰素、细胞组织、抗生素、多糖、色素、抗体等的提取，此外，还被用于稀有金属/贵金属的分离，有效解决了传统方法中存在的溶剂污染、人体危害等问题。

1.3胰岛素前体相关介绍

胰岛素前体，也称为胰岛素原（proinsulin），是胰岛素的前体物质，在胰岛素的生产过程中占据着关键地位。它由胰岛素和C肽组成，具有双重免疫活性，既可与胰岛素抗体结合，又可与C肽抗体结合。胰岛素原由胰岛β细胞合成和分泌，主要在肾脏分解代谢。

从结构上看，胰岛素原由A、B两条肽链通过两个二硫键连接组成，分子量为8647，等电点为5.35。其中A链含有21个氨基酸，B链含有30个氨基酸。在胰岛素的合成过程中，首先由胰岛β细胞核中的DNA转录出胰岛素原的RNA。随后，胰岛素原在胰腺β细胞内经过一系列的加工和修饰，包括被蛋白酶剪切成