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细胞实验技术之细胞周期检测

导读细胞周期是指细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的

时间，它代表着生命从一代向下一代传递的连续过程，与前几期我们

介绍过的细胞学实验（细胞增殖、克隆形成等）一样，细胞周期也是

评价细胞增殖功能的重要实验。流式细胞仪是检测细胞周期最常用的

方法，然而我们会碰到细胞量不够、细胞碎片太多等原因，导致实验

一次次重复，本文就一起看看如何把细胞周期的数据变的更加漂亮，

准确！

一、细胞周期简介

主要分为以下2大过程：

1.分裂间期：间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、

DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）；

2.分裂期M期：细胞分裂期，指细胞分裂开始到结束。

细胞周期图（来自网络）

•注：G0期是指某些细胞在分裂结束后会暂时离开细胞周期，停

止细胞分裂；但在一定适宜刺激下，又可进入周期；

•因为分裂间期持续的时间远远比分裂期持续时间长，在一个正常

细胞周期中，分裂间期时间会占整个细胞周期的90%～95%；

•不同类型细胞的G1期时间长短不同，所以其细胞周期时间存在

差异。如：人类胃上皮细胞为24小时，骨髓细胞为18小时，HeLa细

胞为21小时。

二、常用的实验方法

细胞周期常用检测方法有流式检测法、BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)

掺入法及同位素标记法等，其中流式检测法因适用于大量样品检测，

可快速分析单个细胞的多种特性，是目前最为常用的测定细胞周期的

一种方法，下面就详细介绍如何利用流式细胞仪进行周期分析。

1.流式检测的实验原理

由于细胞周期各时相的DNA含量不同，因此，可通过特异性与

DNA结合染料来检测细胞内的DNA含量来测定细胞周期。流式中常

用碘化丙啶(Propidium，简称PI)与DNA结合，其荧光强度与DNA

含量成正比。因此，通过流式细胞仪对细胞内DNA含量进行检测，同

时获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的

细胞百分率。

2.流式细胞仪的实验步骤

A.收集细胞取适量的对数生长期细胞接种于6cm中，在相应的

条件下（如药物）处理相应时间后，倒去培养基，用胰酶适度消化细

胞，离心收集细胞，弃去上清；

Tips:

•细胞数量：一般情况下，由于在细胞周期中分析的细胞数应达到

1.0*10~3.0*10才具有统计学意义。因此，单次流式细胞仪检测细胞

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周期时，1份样品的细胞数量至少为10；

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•细胞培养时间：一般药物等处理时间最好是大于细胞增殖一代的

周期，可根据具体细胞分裂时间决定，如乳腺癌细胞我们一般处理

24h。

B.清洗及固定细胞用PBS清洗细胞2遍，吸净离心管残余的PBS

后，加入300μLPBS重悬，将细胞吹散，避免细胞成团。随后将细胞

悬液逐滴滴入700μL无水乙醇（预冷），即用70-75%的乙醇固定细

胞，然后4℃固定过夜。

Tips:

•由于流式分析时需要的是单个细胞悬液，因此在操作过程中需充

分混悬细胞；

•细胞固定后，不可过度吹打细胞，以防产生过多的细胞碎片。

C.洗涤细胞次日，离心收集细胞，用移液枪吸走上清，然后用

1mLPBS重悬细胞并离心清洗2~3遍。

Tips:

•细胞可以长期保管在-20℃，可存放1个月，染色不会受影响；

•用PBS重悬细胞时，动作要轻柔。此外，离心速度

（1200rpm/min）不要过快以免造成细胞的破裂。

D.RNA酶消化和PI染色在避光条件下，每个样品加入1避光

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