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表达产物的稳定性

外源基因在大肠杆菌中表达，表达产物对宿主菌而言，是异物，所以大肠杆菌体内常会产生一些蛋白，消化表达产物，采用融合表达，分泌表达，点突变（改变外源蛋白的酶切识别位点），选用蛋白酶缺陷型的宿主菌第62页，共106页，星期日，2025年，2月5日细胞的代谢负荷

大量复制质粒和表达外源基因，会破坏宿主菌原有的代谢平衡减轻细胞代谢负荷的一个方法是菌体的生长和表达外源基因分为两个阶段第63页，共106页，星期日，2025年，2月5日发酵条件的优化第64页，共106页，星期日，2025年，2月5日二、酵母表达系统1.外源基因的拷贝数相对于大肠杆菌，酵母的质粒要少得多，而整合型的质粒，如毕赤酵母，由于拷贝数可以比较高，所以现在用地非常普遍2.外源基因的表达效率1）启动子2）分泌信号的效率3）终止序列的影响4）偏好密码子的使用第65页，共106页，星期日，2025年，2月5日3.外源蛋白的糖基化4.宿主菌的选择1）生长力强2）内源蛋白酶活性弱3）菌株性能稳定4）分泌能力强第66页，共106页，星期日，2025年，2月5日5.发酵条件的优化第67页，共106页，星期日，2025年，2月5日第八节重组蛋白的复性策略第68页，共106页，星期日，2025年，2月5日包含体（包涵体）：又称光折射体，大肠杆菌高量表达外源基因时，大量的表达产物和DNA碎片、RNA、核糖体等结合在一起形成的一种颗粒包含体中的蛋白质一般是不正确折叠的蛋白，特别是二硫键的错配第69页，共106页，星期日，2025年，2月5日高效表达的目的蛋白在大肠杆菌内形成大量无活性包含体。因无法有效的解决复性问题，在美国每年造成的经济损失就达几十亿美元包含体电镜图第70页，共106页，星期日，2025年，2月5日一、减少包含体的策略温度分泌表达选用合适的宿主菌和载体稀有密码子第71页，共106页，星期日，2025年，2月5日二、包含体的复性包含体是不溶性物质，其中的蛋白质复性一般过程是：用盐酸胍、去污剂（Triton）等处理，是蛋白变成完全随机的结构形式，然后除去变性剂，再重新折叠成结构活性的蛋白第72页，共106页，星期日，2025年，2月5日包含体复性方法溶液中复性反胶束环境复性分子伴侣固相复性第73页，共106页，星期日，2025年，2月5日二硫键形成的方法空气氧化巯基化合物二硫键异构酶混合二硫键交换法第74页，共106页，星期日，2025年，2月5日第九节分离纯化实例第75页，共106页，星期日，2025年，2月5日啤酒酵母表达系统毕赤酵母表达系统裂殖酵母表达系统汉逊酵母表达系统第30页，共106页，星期日，2025年，2月5日Invitrogen公司的pYES2质粒，含2μ复制序列和pUC复制起点，Amp和Ura筛选标记，GAL1启动子和CYC2终止子pPIC9K全长9.3Kb，原核有氨苄和卡那抗性，真核中是组氨酸和HG418筛选标记，有和染色体重组的整合位点，在多克隆位点的上游有信号肽序列，用甲醇诱导表达第31页，共106页，星期日，2025年，2月5日pYES2半乳糖激酶启动子第32页，共106页，星期日，2025年，2月5日pPIC9K甲醇氧化酶启动子目前已发现的、最强的真核启动子第33页，共106页，星期日，2025年，2月5日第四节基因工程制药上游技术第34页，共106页，星期日，2025年，2月5日一、目的基因的获得1.化学合成法在核酸合成以上可以自动合成一条单链的寡聚核苷酸，准确率比较高，但是费用也高稍微长一点的基因，可以用互为引物PCR方法获得再长一点的基因，可以用几个粘末端的双链片段通过连接酶连接组装而成第35页，共106页，星期日，2025年，2月5日2.PCR法如果知道基因序列，且基因没有内含子，就可以通过合成引物，通过PCR的方法人工合成基因3.逆转录法对有内含子的基因常采用的方法，具体工程为：提取细胞或组织的总RNA，用逆转录酶和OligodT合成cDNA的第一链，再通过PCR方法合成第二连第36页，共106页，星期日，2025年，2月5日二、目的基因的克隆一般是将目的基因连接到T载体上，但有时候这一步可以省略第37页，共106页，星期日，2025年，2月5日三、基因的体外重组双酶切T载体和表达载体，体外连接第38页，共106页，星期日，2025年，2月5日四、重组产物转入到宿主