实验动物神经细胞培养规程.docxVIP

实验动物神经细胞培养规程

###一、概述

神经细胞培养是研究神经生物学基础、药物筛选及神经退行性疾病的重要技术手段。本规程旨在提供一套标准化、规范化的实验动物神经细胞培养操作流程，确保实验结果的准确性和可重复性。本规程涵盖神经细胞的原代培养、传代、分化及保存等关键环节，适用于科研及教学领域的神经细胞实验操作。

###二、实验准备

####（一）材料与设备

1.**细胞培养耗材**

-PLO（聚丙烯酸酯）或TC处理过的培养皿、细胞培养瓶、六孔板等。

-0.22μm无菌滤膜（用于过滤培养基）。

-细胞计数板、移液器吸头等。

2.**试剂与培养基**

-DMEM/F12培养基（含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素）。

-N2补充剂（B27）、L-谷氨酰胺（1mmol/L）。

-胰蛋白酶（0.25%）、EDTA（0.02%）。

3.**设备**

-CO2培养箱（37℃，5%CO2）。

-超净工作台（用于无菌操作）。

-冰箱（-80℃保存细胞）。

####（二）实验环境

1.**无菌操作**：所有操作需在超净工作台内进行，操作前需用75%酒精消毒工作台面及手部。

2.**培养基预热**：培养基需在37℃预热30分钟，避免温度骤变影响细胞活性。

###三、神经细胞原代培养

####（一）组织获取

1.**动物麻醉**：使用异氟烷或戊巴比妥对实验动物（如新生大鼠、小鼠）进行麻醉。

2.**脑组织分离**：沿矢状缝剪开颅骨，取出脑组织，置于冰冷的PBS缓冲液中清洗。

3.**脑区选择**：根据实验需求选择特定脑区（如海马、皮质），剔除血管及非神经组织。

####（二）组织消化与细胞解离

1.**酶消化**：将脑组织剪成1mm3小块，加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA混合酶溶液，37℃消化20-30分钟。

2.**机械分散**：加入含血清的培养基终止消化，用细胞计数板计数细胞密度，调整细胞悬液浓度至1×104-5×104cells/mL。

####（三）细胞接种

1.**培养皿预处理**：培养皿底部需预贴聚赖氨酸或层粘连蛋白（Laminin）以促进神经细胞附着。

2.**接种细胞**：吸取细胞悬液，接种于培养皿或培养瓶中，每皿约1×105cells。

3.**初始培养**：37℃，5%CO2培养箱中培养24小时，期间更换培养基以去除未附着细胞。

###四、细胞传代与分化

####（一）细胞传代

1.**消化处理**：待细胞贴壁后（约24-48小时），用0.25%胰蛋白酶+EDTA消化，吹打形成细胞悬液。

2.**计数与稀释**：用细胞计数板计数，按1:3-1:4比例稀释，重新接种于培养皿。

####（二）神经细胞分化

1.**更换诱导培养基**：去除原培养基，加入含B27补充剂、N2及抑制增殖因子的分化培养基（如B27替代血清）。

2.**分化培养**：37℃，5%CO2培养箱中分化3-7天，期间更换培养基（每2-3天更换一次）。

###五、细胞保存与冻存

####（一）细胞保存**

1.**低温保存**：待细胞生长至80%-90%汇合度时，用胰蛋白酶消化并收集细胞。

2.**冻存方法**：加入冻存液（含10%DMSO、基础培养基），分装后置于-80℃保存。

####（二）细胞复苏**

1.**快速解冻**：将细胞悬液置于37℃水浴中快速融化，立即加入预温培养基。

2.**重接种**：接种于预贴层的培养皿中，37℃，5%CO2培养箱中培养24小时。

###六、注意事项

1.**无菌操作**：所有步骤需避免污染，定期更换超净工作台滤网。

2.**细胞密度**：接种密度过高或过低均会影响细胞活性，需严格控制。

3.**培养基成分**：确保培养基新鲜配制，避免反复冻融。

###七、质量控制

1.**细胞形态观察**：定期通过显微镜观察细胞形态及生长状态。

2.**活力检测**：使用台盼蓝染色法检测细胞活力（活细胞率≥90%为合格）。

3.**传代次数**：神经细胞原代培养一般传代3-5次，避免过度传代导致细胞衰老。

###五、细胞保存与冻存（续）

####（一）细胞保存**

1.**细胞计数与活力检测**：

(1)在进行冻存前，需对细胞进行精确计数，使用细胞计数板和显微镜计数活细胞数量，确保细胞悬液浓度均匀。

(2)进行台盼蓝染色法或MTT法检测细胞活力，确保活细胞率大于95%，不合格细胞需重新消化或调整培养基。

2.**冻存液配制**：

(1)标准冻存液通常包含以下成分：基础培养基（如DMEM/F12）、10%-15%DMSO（二甲基亚砜，作为冷冻保护剂）、以及必要的生长因子（