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GB/T44610—2024

食用菌病害检疫鉴定方法

1范围

本文件描述了食用菌病害的检疫鉴定方法。

本文件适用于检测和鉴定国内生产和进口的各类食用菌子实体的真菌病害、细菌病害和病毒病害。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T12728食用菌术语

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27402实验室质量控制规范植物检疫

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

GB/T12728界定的术语和定义适用于本文件。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Ct：循环阈值（CycleThreshold）

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（CetylTrimethylAmmoniumBromide）

DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

OD：光密度（OpticalDensity）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

PDA：马铃薯葡萄糖琼脂（PotatoDextroseAgar）

RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）

RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）

5总体要求

根据病害种类的不同，一般根据形态学特征、分子生物学特征、致病性特征、生理生化特征等进行种类鉴定，应采用多种检测方法综合进行结果判定。

在整个试验操作过程中应采用安全有效的防护措施，具体要求应符合GB19489、GB/T27402、GB/T27403的规定。

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GB/T44610—2024

6仪器及用具

6.1仪器设备

6.1.1生物光学显微镜。

6.1.2电子显微镜。

6.1.3低温冰箱。

6.2试验用具

6.2.1解剖针。

6.2.2标签。

6.2.3镊子。

6.2.4PCR管（0.2mL）。

6.3试剂

除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。

6.3.1水：GB/T6682，三级。

6.3.2琼脂糖（C10H15N3O3）。

7现场取样

宜挑选子实体表面有腐烂、斑点、变色、霉层、畸形等症状的样品，如无明显症状，尽量从不同部位多点取样，用标签做好标记，带回实验室进行检测鉴定。常见重要食用菌病害症状描述见附录A。

8病害检疫鉴定

8.1形态学鉴定

8.1.1真菌病害

若发病处可见病菌，则直接用镊子或解剖针挑取寄主发病处的病菌，或取分离纯化培养生长5d~7d后的病菌平板培养物，在普通生物光学显微镜下观察病原菌的形态特征。

在10×20、10×40放大倍数下进行观测，随机选取10个～15个视野，测量并观察病原菌无性态（如分生孢子器、分生孢子等）以及有性态（如子囊壳、子囊孢子等）的大小、形态、颜色等，并进行数码显微拍摄对测量数值进行记录。对于分离培养的病菌，同时观察菌落的形态、颜色变化等，拍照留存并对病原菌进行类别判定。

真菌的分离、纯化及保存方式见附录B。

8.1.2细菌病害

对于疑似细菌性病害在进行病原分离之前，先切取食用菌发病部分组织做“细菌溢”检查，如在光学显微镜下观察到明显喷菌现象，再进行细菌的组织分离。

将食用菌发病部位剪成小块（约0.2cm×0.2cm）进行分离纯化，革兰氏染色，观察其菌体；还可通过相应的染色方法观察其是否具有鞭毛、荚膜等，具体方法见附录C。对所观察的形态特征进行拍照留存，并对病原菌进行类别判定。

细菌的分离、纯化及保存方式见附录B。

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8.1.3病毒病害

对于病毒病害，通过粗提的方法得到子实体的病毒粒子，对其进行负染，借助电子显微镜观察其形态特征，获取病毒粒子的形态大小、内部结构和有无包膜等信息。对所观察的形态特征进行拍照留存，对病毒进行类别判定。

8.2分子生物学检测

8.2.1核酸提取

取分离纯化得到的真菌或细菌菌落进行DNA提取，疑似病毒病害的样品一般进行DNA和RNA提取。核酸提取方法可采用CTAB法、Trizol法、试剂盒法等，按照不同提取方法的说明书操作。核酸提取后检测核酸浓度和纯度，并