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反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相：制备工艺与蛋白质组学应用新探

一、引言

1.1研究背景与意义

在色谱分析领域，固定相的性能对分离效果起着决定性作用。反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相凭借其独特的双重分离机制，成为近年来的研究热点。传统的单一模式色谱固定相，如反相色谱固定相，虽对非极性和弱极性化合物具有良好的分离效果，但对于极性和离子型化合物的保留和分离能力有限。而离子交换色谱固定相则主要适用于离子型化合物的分离。随着分析样品的日益复杂，对色谱分离技术的要求也越来越高，单一模式色谱固定相已难以满足复杂样品分析的需求。反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相将反相色谱和弱阳离子交换色谱的分离机制结合在一起，能够同时利用疏水作用和静电作用对样品进行分离，大大提高了分离的选择性和分辨率，为复杂样品的分离分析提供了更有效的手段。

蛋白质组学作为后基因组时代的重要研究领域，旨在全面研究生物体蛋白质的表达、结构、功能及其相互作用。液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）是蛋白质组学研究的核心技术之一，其中色谱分离作为关键的前处理步骤，直接影响着蛋白质和多肽的鉴定和定量分析结果。由于生物样品中蛋白质和多肽的组成极为复杂，且含量差异巨大，传统的单一模式反相色谱分离方法难以实现对复杂蛋白质组的高效分离和分析。反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相在蛋白质组学研究中具有重要的应用价值。它不仅可以通过反相作用对疏水性肽段进行分离，还能利用弱阳离子交换作用对带正电荷的肽段进行选择性保留和分离，从而有效提高蛋白质组的鉴定覆盖率和定量准确性。此外，该混合模式固定相还能解决肽段疏水性太强而引起的不可逆吸附问题，减少样品损失，提高分析的灵敏度和重现性。

1.2国内外研究现状

国外对反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相的研究起步较早，在制备方法和应用方面取得了一系列重要成果。例如，Nogueira等通过化学键合的方法将十八烷基和羧基同时键合到硅胶表面，制备了反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相，并将其应用于多肽和蛋白质的分离分析，取得了较好的分离效果。在蛋白质组学研究中，国外学者也广泛应用该混合模式固定相进行复杂生物样品的分析。如Zeng等将强阳离子交换柱与反相色谱柱在线联用分析鼠肝蛋白组，提高了蛋白质组的鉴定效率。

国内在这一领域的研究也取得了显著进展。梁鑫淼等通过极性共聚的方法制备了C18WCX反相/离子交换作用混合模式色谱填料，极大地提高了蛋白质与多肽的鉴定数量，并且在磷酸化肽的富集中获得了更高的选择性。此外，国内学者还通过点击化学等方法制备了多种新型的反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相，并对其色谱性能和应用进行了深入研究。

然而，当前的研究仍存在一些不足之处。一方面，现有的制备方法存在反应条件苛刻、步骤繁琐、产率低等问题，限制了固定相的大规模制备和应用。另一方面，在蛋白质组学研究中，该混合模式固定相的应用还不够广泛，对于一些复杂生物样品的分离分析效果仍有待提高。此外，对于固定相的结构与性能之间的关系以及分离机理的研究还不够深入，需要进一步加强。

1.3研究目的与内容

本研究旨在制备一种性能优良的反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相，并将其应用于蛋白质组学研究，以提高蛋白质组的鉴定覆盖率和定量准确性。具体研究内容包括：

探索一种简单、高效、可重复性好的反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相的制备方法，优化制备条件，提高固定相的键合量和稳定性。

对制备的固定相进行全面的表征，包括结构表征、表面性质表征和色谱性能表征，深入研究固定相的结构与性能之间的关系。

将制备的反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相应用于蛋白质组学研究，建立基于该固定相的液相色谱-质谱联用分析方法，对标准蛋白质酶切肽段混合物和实际生物样品（如细胞裂解液）中的蛋白质组进行分离分析，评价其在蛋白质组学研究中的应用效果。

探讨反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相在蛋白质组学研究中的分离机理，为其进一步优化和应用提供理论依据。

1.4研究方法与技术路线

本研究采用实验研究与理论分析相结合的方法。在固定相制备方面，通过硅烷偶联反应、巯基-烯点击化学反应等方法，将反相基团和弱阳离子交换基团键合到硅胶表面，制备反相/弱阳离子交换混合模式色谱固定相。利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、核磁共振波谱（NMR）、元素分析等手段对固定相的结构进行表征；采用比表面积分析、孔径分布分析、表面电位分析等方法对固定相的表面性质进行研究；通过高效液相色谱分析，考察固定相对不同类型化合物的保留行为和分离性能，评价其色谱性能。

在蛋白质组学研究应用方面，采用胰蛋白酶对标准蛋白质（如牛血清白蛋白