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荧光定量PCR引物设计

专业的定量PCR设计软件：beaconDesigner

有时一对100分的引物扩增效率特别低，换了一对貌似很烂的引物，结果溶解曲线却长得很漂亮～扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关

看引物Tm值相差是否很高，适当降低反应退火温度，看看是否有效

看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高，比方水稻基cDNA扩增常常用到GCbuffer。

看所用扩增基因是否为组织特异性表达

看RNA是否完整是否降解，反转录过程是否完整

设好内参正对照

最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧，

（1）设计的时候尽量靠近基因的3端，这样能最大限度地保证扩增效率

（2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染

（3）两条引物的Tm值不要相差太大

（4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300bp。.如果想同时检测很多对基因的变化，最好设计的时候记录下产物的Tm值，这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。保证在产物Tm80以上（一般Tm=80以下的峰都是引物二聚体），对于水稻等GC含量比较高的基因组，产物Tm不要高于94(个人观点)。如果同时检测很多对基因的表达量变化，我会尽量调整所有产物的Tm值与内参产物的Tm相差不太大，这样方便实验操作和最后的分析。

（3）相对错配来说，我认为dimer和harpin对realtimePCR的影响更大（当然，也别错配得太邪门了，非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的错配就死了），引物的3端不要有错配。

（5）一般我们用PrimerPremier设计软件，我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物，找到一条评分是100的，再在它左右合适的位置手动搜索有没有合适和它配对的评分也比较高的引物，一般5分钟之内可以搞定一个基因。

实时定量PCR引物设计的具体要求

1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区5端的300-400bp区域内，可以用DNAMAN，Alignment软件看看结果。

2、不能形成2级结构。

3、引物长度一般在17-25bp之间，上下游引物不能相差太大。

4、G+C含量在40-60%之间，45-55%最佳。

5、碱基要随机分布，尽量均匀。

6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。

7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。

8、引物5‘端可以修饰。

9、3’端不可修饰，而且要避开AT，GCrich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。

10、引物3端要避开密码子的第三位。

11、引物整体设计自由能分布5端大于3‘端。

12、定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp。

实时定量PCR完全手册

方法简介

所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：

大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。

存在的问题

由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：

1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品

2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞

3.总RNA或者mRNA

4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略

5.不同的酶以及酶的不同组合

6.变异系数、灵敏度

7.多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。

8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。

RNA质量评价

现在RNA定量的程序很多。最近EMBOqPCRcourse(http://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28)比较了用Ribogreen,AgilentBioAnalyser,spectrophotometer,NanodropandtheBioRadExperion来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。

RNA质量

RNA质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280