膜分离和电泳课件.pptVIP

Stoke’sLaw（斯托克斯定律）如果把生物大分子的膠體溶液放在一個沒有干擾的電場中，使顆粒具有恒定遷移速率的驅動力來自於顆粒上的有效電荷Q和電位梯度E，它們與介質的摩擦阻力f相抗衡，這種抗衡服從斯托克斯定律：f=6πrvηv是介質粘度為η中半徑為r的顆粒的移動速度。但實際情況中，f還取決於凝膠厚度、顆粒尺寸、甚至是介質的內滲等。電泳遷移率電泳遷移率（mobility）:在電位梯度E的影響下，帶電顆粒在時間t中的遷移距離d。其單位是cm2·sec-1·V-1電泳遷移率的不同提供了從混合物中分離不同物質的基礎電泳的大致分類依據電泳原理，現有三種形式的電泳分離系統移動介面電泳（movingboundaryelectrophoresis）區帶電泳（zoneelectrophoresis）穩態電泳（steadystateelectrophoresis）其中區帶電泳是目前常用的電泳系統。區帶電泳的主要技術區帶電泳中的常用技術載體電泳：粉末電泳、紙電泳、凝膠電泳、聚焦電泳無載體電泳：自由電泳、毛細管電泳凝膠電泳作為電泳支持介質必須具有：化學惰性、不干擾大分子的電泳過程，化學穩定性好、均勻、重複性好、電內滲小等特性。凝膠電泳的支持介質：聚丙烯醯胺凝膠（polyacrylamidegel,PGA） 由丙烯醯胺和交聯劑N，N’-甲叉雙丙烯醯胺在引發劑和增速劑的作用下，聚合而成；瓊脂糖凝膠： 從瓊脂中精製分離出的膠狀多糖，其分子結構大部分是由1,3連接的β-D吡喃半乳糖和1,4連接的3,6脫水α-D吡喃半乳糖交替形成的；丙烯醯胺的聚合丙烯醯胺的聚合通常是由化學或光化學過程完成的，通常採用過硫酸銨、過硫酸鉀或核黃素（引發劑）來引發該過程；以N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）為增速劑。該引發-增速的催化系統實質是自由基催化的氧化-還原過程。丙烯醯胺的化學聚合是由過硫酸銨在鹼性條件下，產生游離氧自由基引發單體丙烯醯胺成為自由基狀態，經過一系列的自由基反應得到的聚合物；影響聚合的主要因素引發劑和增速劑的濃度：濃度小易導致聚合速度慢；濃度過大則易導致電泳時的燒膠以及電泳帶的畸變；一般控制使聚合過程在40~60分鐘內完成。系統pH值：酸性條件、鹼性條件均可，但仍然存在一個最佳pH值，以獲得最佳的聚合結果；溫度：低溫下聚合導致凝膠變脆和混濁；適當提高溫度可以是凝膠透明而有彈性；分子氧：分子氧的存在會阻礙凝膠的化學聚合；抽氣系統純度：金屬離子會影響凝膠的聚合；聚丙烯醯胺凝膠電泳中的分子篩效應在使用凝膠介質的電泳中，由於電泳介質具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不僅可以防止對流，而且可以把擴散減到最小。凝膠中的大分子分離取決於它的電荷、尺寸和形狀凝膠的這種用於分離不同尺寸分子的特性是由於它的尺寸篩分能力（Sizesievingcapacity），這種現象被稱為分子篩效應（molecularsievingeffect）分子篩效應圖中A，B，C均為陽離子，在直流電場作用下電泳情況示意圖分子量大小依次為MA=MBMC，所帶電荷量相同QA=QB=QC。ABC+-瓊脂糖凝膠的性能、結構與特點其優點如下：瓊脂糖凝膠孔徑較大，0.075%瓊脂糖的孔徑為800nm，可以分析百萬道爾頓分子量的大分子，但解析度較凝膠電泳低。機械強度高：可以在濃度1%以下使用；無毒；染色、脫色程式簡單，背景色較低；熱可逆性；生物中性：一般不與生物材料結合；電內滲（EEO）大：對於對流電泳有益電泳新介質N-取代聚丙烯醯胺介質：Poly-N-acryl-tris(NAT)gelN-AcryloylsugarsAcryloylmorpholineHydrolinkgelsN-acryloylaminoethoxyethanol(AAEE)特點：具有極強的水解穩定性具有高度親水性孔徑大電泳系統的基本組成電泳槽：是凝膠電泳系統的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳槽、水準板電泳槽電源:聚丙烯醯胺凝膠電泳200~600V，載體兩性電解質等電聚焦電泳1000~2000V，固相梯度等電聚焦3000~8000V外迴圈恒溫系統:高電壓會產生高熱，需冷卻；凝膠乾燥器:用於電泳和染色後的乾燥；灌膠模具：制膠，玻璃板和梳子；電泳轉移裝置：利用低電壓，大電流的直流電場，使凝膠電泳的分離區帶或電泳斑點轉移到特定的膜上，如PVDF膜電泳洗脫儀：回收樣品凝膠掃描和攝錄裝置：對電泳區帶進行掃描，從而給出定量的結果。垂直電泳槽及灌膠模具電泳的一般過程常規聚丙烯醯胺凝膠