第二章荧光分光度法.ppt

荧光强度与荧光物质浓度的关系定量分析方法六、定量分析方法第61页，共94页，星期日，2025年，2月5日（一）荧光强度与荧光物质浓度的关系用强度为I0的入射光，照射到样品池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If用仪器测得，在荧光浓度很稀(A0.05)时，荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系：If=?fIa=?f（I0-I）Ia为吸收的辐射强度I0为入射光强度荧光池I0IIf荧光强度检测器If=?f（I0-I010-A）=?fI0（1-e-2.3A）I=I010-A将上式展开第62页，共94页，星期日，2025年，2月5日当A﹤0.05时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化If=2.3?fI0A=2.3?fI0?bc当A﹤0.05时，If与?f、I0、?和c有关，对一给定物质，当激发光波长和强度一定时，?f、I0、?和b为常数，合并为KIf=KCIp=KC定量分析依据第63页，共94页，星期日，2025年，2月5日荧光强度与物质浓度呈线形关系，If=KC只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高浓度高时，If与C不呈线形关系，有时C增大，If反而降低因为公式[]中后面影响，有时发生荧光猝灭效应注意：第64页，共94页，星期日，2025年，2月5日（二）定量分析方法定量分析依据If=KCIp=KC1.标准曲线法——最常用的定量分析方法将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，配制一系列标准液，测定它们的相对发光强度。以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标浓度C1C2C3C4C5Cx荧光强度If1If2If3If4If5IfxIfIfxCxC第65页，共94页，星期日，2025年，2月5日2.比较法——比较简单如果试样数量不多，可用比较法进行测量配一标准溶液浓度为Cs，Cs与未知液浓度Cx相近，并在相同条件下测定它们的荧光强度未知液Ifx=KCx标准液Ifs=KCs比较第66页，共94页，星期日，2025年，2月5日2、单色器荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长?ex，用此激发光激发样品池内的荧光物质?ex第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长?em。在选定的?em下测定荧光强度，定量分析第29页，共94页，星期日，2025年，2月5日3、样品池盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边4、检测器把光信号转化成电信号,放大,直接转成荧光强度荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可大大提高荧光强度5、读出装置记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱第30页，共94页，星期日，2025年，2月5日磷光分析仪器与荧光分析仪器相似，主要差异如下：1.试样室试样需在液氮温度（77K，-196℃）下测定低温磷光（将样品池放在盛放液氮的杜瓦瓶内）固体表面室温磷光分析需特制试样室2.磷光镜有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。用机械切光装置——磷光镜区别荧光和磷光。利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰。第31页，共94页，星期日，2025年，2月5日三、激发光谱与发射光谱罗丹明B激发光谱罗丹明B发射光谱罗丹明B激发和发射光谱第32页，共94页，星期日，2025年，2月5日三、激发光谱与发射光谱硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱任何荧光物质都具有两个特征光谱，即激发光谱和荧光光谱。激发光谱:是指不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光所得的光谱。获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的?em不变，改变第一单色器波长，从200~700nm扫描，让不同