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透明质酸生产菌溶血素-S基因缺失突变菌株的构建与特性解析

一、绪论

1.1透明质酸概述

透明质酸（HyaluronicAcid，HA），又称玻尿酸、玻璃酸，分子式为(C_{14}H_{21}NO_{11})n，是一种由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,3糖苷键和β-1,4糖苷键交替连接形成双糖单元，众多双糖单元相连而成的线性大分子酸性黏多糖。其外观呈白色无定形固体，无臭无味，易溶于水，吸湿性强，不溶于醇、酮、乙醚等有机溶剂，商品透明质酸常以钠盐即透明质酸钠的形式存在，为白色无定形或纤维状粉末。不同生物体中透明质酸的分子量有所差异，范围通常在2??10^{5}???7??10^{6}，双糖单位数约为300-11100，其水溶液带负电、呈酸性，浓度较高时，分子间因氢键作用形成物理交联，呈网状结构，表现出非牛顿流体行为，具备较高的黏弹性与渗透压。

透明质酸独特的理化性质使其在多个领域有着重要应用。在医疗领域，可用于眼科手术，如白内障手术、青光眼手术等，起到维持眼内压、保护角膜内皮细胞等作用；在骨科方面，能作为关节润滑剂，缓解骨性关节炎等疾病症状，促进软骨修复；还可用于伤口敷料，促进伤口愈合，减少疤痕形成。在化妆品领域，透明质酸凭借卓越的保湿性能，被广泛添加到各类护肤品中，能在皮肤表面形成水化膜，维持皮肤水分，增强皮肤弹性，延缓皮肤衰老。在食品领域，随着透明质酸钠被批准为新食品原料，其可添加于乳及乳制品、饮料类、酒类等食品中，为消费者提供保健功效。

目前，透明质酸的生产工艺主要有动物组织提取法和微生物发酵法。动物组织提取法多以鸡冠、人脐带等为原料，通过浸泡、过滤、沉淀等一系列复杂操作提取透明质酸。此方法虽能获得高纯度产品，但原料来源有限、提取率低、成本高，难以实现大规模工业化生产。微生物发酵法是利用链球菌、肠球菌等微生物，以葡萄糖等为碳源，蛋白胨等为氮源，在适宜条件下发酵生产透明质酸。该方法不受原料资源限制，操作简便，产率较高，还可通过调控发酵条件生产不同分子量的透明质酸，逐渐成为主流生产方式。

1.2透明质酸生产菌种

在透明质酸的微生物发酵生产中，马链球菌兽疫亚种（Streptococcusequisubsp.zooepidemicus）是主要的生产菌种之一。马链球菌兽疫亚种属于兰氏分群的C群β溶血链球菌，广泛存在于动物的皮肤、呼吸道、扁桃体及生殖道等部位，能导致多种家畜发生炎症和败血症，对马、牛、羊、猪等动物的健康造成威胁，在猪身上可引发脑膜炎、败血症、关节炎等疾病。但从生产角度看，在特定的发酵条件下，利用葡萄糖、酵母粉、蛋白胨等物质作为培养基，马链球菌兽疫亚种能够高效合成透明质酸钠。

然而，马链球菌兽疫亚种作为病原菌，其携带的多种毒力因子给透明质酸生产带来了挑战。溶血素-S（SlyS）便是其中一种重要毒力因子，它是一种由细菌分泌的蛋白质毒素，具有破坏红细胞、溶解细胞膜的能力。在发酵过程中，溶血素-S的存在可能会对发酵体系产生负面影响，如破坏细胞结构，影响菌体生长和代谢，进而干扰透明质酸的合成；同时，在透明质酸的分离纯化过程中，溶血素-S的残留也会增加纯化难度，降低产品质量，若最终产品中含有微量的溶血素-S，可能对人体产生潜在危害，尤其是应用于医疗和食品领域时，会严重影响产品的安全性和可靠性。因此，深入研究马链球菌兽疫亚种的毒力因子，尤其是溶血素-S基因，并对其进行改造，对于优化透明质酸生产工艺、提高产品质量具有重要意义。

1.3研究目的与意义

本研究旨在构建溶血素-S基因缺失突变菌株，通过基因工程技术，精准敲除马链球菌兽疫亚种中的溶血素-S基因，从根本上消除溶血素-S对透明质酸生产过程的干扰。通过对比野生型菌株和突变菌株在生长特性、发酵性能、透明质酸合成能力等方面的差异，全面评估溶血素-S基因缺失对菌株的影响，进一步优化发酵工艺条件，提高透明质酸的产量和质量。

构建溶血素-S基因缺失突变菌株对于透明质酸生产产业具有多方面的重要意义。从生产角度而言，消除溶血素-S的不良影响后，可有效提升发酵过程的稳定性和可控性，减少因菌体生长异常和代谢紊乱导致的生产波动，从而提高透明质酸的生产效率，降低生产成本。在产品质量方面，避免了溶血素-S残留对产品纯度和安全性的威胁，有助于生产出符合更高质量标准的透明质酸产品，满足医疗、食品等高要求领域的需求。从生物安全性角度看，降低了马链球菌兽疫亚种的致病性，减少了生产过程中潜在的生物安全风险，为透明质酸的安全生产提供保障，促进整个透明质酸产业的可持续发展。

1.4实验技术路线

本研究的实验技术路线主要包括以下关键步骤：首先，采用PCR技术扩增马链球菌兽疫