双分子荧光互补技术：活体细胞中RNA G-四链体结构检测的新突破.docxVIP

双分子荧光互补技术：活体细胞中RNAG-四链体结构检测的新突破

一、引言

1.1研究背景

RNAG-四链体（rG4s）是一种由富含鸟嘌呤（G）的RNA序列形成的非经典二级结构。在过去几十年里，rG4s在细胞生命活动中的关键作用逐渐被揭示，成为生命科学领域的研究热点。

rG4s广泛分布于各类RNA分子中，包括mRNA、lncRNA、circRNA和miRNA等，其结构的形成和稳定性受到多种因素的调控，如离子浓度、温度、RNA结合蛋白以及小分子配体等。研究表明，rG4s参与了众多重要的细胞生理过程，如转录、翻译、mRNA剪接、RNA运输和稳定性调控等。在转录水平，启动子区域的rG4s可通过影响RNA聚合酶的结合和活性，调控基因的转录起始和延伸；在翻译过程中，5-UTR或编码区的rG4s能够调节核糖体的结合和移动，进而影响蛋白质的合成效率和准确性。此外，rG4s还与一些疾病的发生发展密切相关，如癌症、神经退行性疾病和病毒感染等。在癌症中，某些癌基因或抑癌基因mRNA上的rG4s结构变化可能导致基因表达异常，促进癌细胞的增殖、侵袭和转移；在神经退行性疾病中，rG4s的异常聚集与蛋白质错误折叠和神经毒性的产生有关。因此，深入研究rG4s在细胞内的形成、分布、功能及调控机制，对于理解生命过程的本质和揭示相关疾病的发病机制具有重要意义。

尽管rG4s在细胞生命活动中扮演着如此重要的角色，但目前对其在活体细胞内的研究仍面临诸多挑战，其中关键的问题之一就是缺乏高效、特异且能够在生理条件下实时检测rG4s的技术。传统的检测方法，如体外凝胶电泳迁移率变动分析（EMSA）、圆二色谱（CD）和核磁共振（NMR）等，虽然能够在体外对rG4s的结构和性质进行详细表征，但这些方法往往需要对RNA进行体外纯化和大量制备，无法直接反映rG4s在活体细胞内的真实状态；而基于核酸杂交或抗体识别的方法，在细胞内的应用受到核酸探针或抗体的通透性、特异性和稳定性等因素的限制。因此，开发一种能够在活体细胞中特异性检测rG4s形成的新技术，对于推动rG4s相关研究的深入开展至关重要。

1.2研究目的与意义

本研究旨在运用双分子荧光互补（BiFC）技术，建立一种能够在活体细胞中特异性检测RNAG-四链体结构形成的新方法。具体而言，通过合理设计与rG4s特异性结合的探针蛋白，并将其与荧光蛋白的拆分片段融合，利用BiFC技术的原理，当探针蛋白与目标rG4s结合时，荧光蛋白的拆分片段相互靠近并重新组装成完整的荧光蛋白，从而发出荧光信号，实现对活体细胞内rG4s形成的可视化检测。

本研究的意义主要体现在以下几个方面：首先，从基础研究角度，该方法为深入探究rG4s在细胞内的生物学功能和调控机制提供了有力工具。通过实时监测rG4s在不同细胞生理状态下的形成和变化，有助于揭示rG4s参与细胞生命活动的具体分子机制，填补我们对rG4s在活体细胞内动态行为认识的空白。其次，在疾病研究领域，能够准确检测rG4s在病变细胞中的异常表达和结构改变，对于理解相关疾病的发病机制具有重要意义，为开发基于rG4s的新型诊断标志物和治疗靶点提供了新的思路和方法。此外，本研究建立的技术平台还具有广泛的应用前景，可拓展到其他非经典核酸结构的检测研究中，推动核酸结构生物学领域的发展。

二、相关理论基础

2.1RNAG-四链体结构

2.1.1结构特征与形成机制

RNAG-四链体（rG4s）是由富含鸟嘌呤（G）的RNA序列形成的独特二级结构，其基本构建单元是G-四分体（G-quartet）。在G-四分体中，四个鸟嘌呤碱基通过Hoogsteen氢键相互作用，形成一个平面正方形结构，每个鸟嘌呤的N7位与相邻鸟嘌呤的O6位形成氢键，而N1位与另一个相邻鸟嘌呤的N2位形成氢键，这种特殊的氢键模式赋予了G-四分体高度的稳定性。多个G-四分体在一价阳离子（如K?、Na?）存在的情况下，通过π-π堆积作用上下堆叠，形成rG4s的核心结构。除了G-四分体，rG4s还包含连接不同G-四分体的Loop区域，Loop的长度、序列和构象对rG4s的整体结构和稳定性也有着重要影响。根据G-链的方向和Loop的位置，rG4s可分为平行、反平行和混合型三种拓扑结构。在平行结构中，四条G-链具有相同的方向，Loop区域位于G-四链体的同一侧；反平行结构中，G-链的方向相反，Loop区域分布在G-四链体的不同侧面；混合型则兼具平行和反平行结构的特点。

rG4s的形成