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细菌的革兰氏染色实验报告

一、实验目的

通过革兰氏染色法，将不同种类的细菌区分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，以便对细菌进行初步的形态学分类和鉴定，同时了解革兰氏染色的原理和操作方法。

二、实验原理

革兰氏染色的原理主要基于细菌细胞壁结构的差异。革兰氏阳性菌细胞壁较厚，肽聚糖含量高，交联度大，脂类含量低。当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成紫色，然后用碘液媒染，碘与结晶紫形成复合物，进一步增强了染料与细菌的结合。接着用酒精脱色，由于革兰氏阳性菌细胞壁的肽聚糖层厚，网络结构紧密，酒精脱水作用使细胞壁收缩，孔隙变小，结晶紫碘复合物被阻留在细胞内，细菌仍呈紫色。而革兰氏阴性菌细胞壁薄，肽聚糖含量低，交联度小，脂类含量高，酒精脱色时，脂类物质溶解，细胞壁通透性增加，结晶紫碘复合物被洗脱，细菌变为无色，再用番红复染后呈红色。

三、实验材料

1、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌

2、染色剂：结晶紫染液、碘液、95%酒精、番红染液

3、其他材料：载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、香柏油、擦镜纸等

四、实验步骤

1、涂片

取一块干净的载玻片，用记号笔在载玻片中央画一个小圈。

用接种环分别取一环大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液，在载玻片的小圈内均匀涂布，注意涂片要薄而均匀。

将涂片在酒精灯火焰上微微加热固定，使细菌牢固地附着在载玻片上，加热时要不断移动载玻片，避免过热。

2、初染

在涂有细菌的部位滴加结晶紫染液，染色12分钟。

用蒸馏水缓慢冲洗载玻片上的染液，直至水流清澈，使多余的染液被洗去。

3、媒染

滴加碘液覆盖涂片部位，作用12分钟。

同样用蒸馏水冲洗，洗去碘液。

4、脱色

倾斜载玻片，在涂片部位缓慢滴加95%酒精进行脱色，约30秒至1分钟，同时轻轻晃动载玻片，使酒精均匀地流过涂片。

当流出的酒精无明显紫色时，立即用蒸馏水冲洗，终止脱色。

5、复染

在涂片部位滴加番红染液，染色12分钟。

用蒸馏水冲洗，洗去多余的番红染液。

6、干燥

用吸水纸轻轻吸干载玻片上的水分，使涂片自然干燥。

7、镜检

在载玻片上滴加一滴香柏油，将涂片置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到细菌涂片区域，然后转换高倍镜观察。

观察细菌的形态和颜色，区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，呈紫色；大肠杆菌为革兰氏阴性菌，呈红色。观察完毕后，用擦镜纸擦去镜头上的香柏油。

五、实验结果

1、金黄色葡萄球菌

在显微镜下观察到金黄色葡萄球菌呈葡萄串状排列，细胞呈球形。经过革兰氏染色后，细胞被染成紫色，为革兰氏阳性菌。这是因为其细胞壁较厚，肽聚糖含量高，在酒精脱色过程中，细胞壁收缩，阻止了结晶紫碘复合物的洗脱，所以仍保留紫色。

2、大肠杆菌

大肠杆菌为短杆菌，单个或成双排列。革兰氏染色后，细胞呈红色，是革兰氏阴性菌。这是由于其细胞壁薄，肽聚糖含量低，脂类含量高，酒精脱色时脂类溶解，细胞壁通透性增加，结晶紫碘复合物被洗脱，再经番红复染后呈红色。

六、讨论

1、实验操作要点

涂片时要注意菌液的浓度，不能太浓也不能太稀，太浓会导致细菌堆积，影响观察；太稀则可能找不到细菌。涂片要均匀，否则染色效果不一致。

加热固定时温度不宜过高，时间不宜过长，以免细菌形态被破坏。

脱色是革兰氏染色的关键步骤，脱色时间要严格控制。脱色不足，革兰氏阴性菌可能被误染为阳性；脱色过度，革兰氏阳性菌可能被误染为阴性。一般通过观察流出酒精的颜色变化来判断脱色程度，当流出酒精无明显紫色时，立即终止脱色。

复染时间也需要适当掌握，时间过短可能复染不充分，影响结果观察；时间过长则背景颜色过深，也不利于观察。

2、影响染色结果的因素

细菌的菌龄对染色结果有影响。一般来说，对数生长期的细菌染色效果较好，老龄菌可能会出现染色异常，如革兰氏阳性菌可能会染成革兰氏阴性菌的颜色。这可能是由于老龄菌细胞壁结构发生了变化。

染色剂的质量也很重要。如果染色剂存放时间过长或保存不当，可能会影响其染色效果。例如，结晶紫染液放置过久可能会出现沉淀，影响染色的均匀性。

操作过程中的误差也会导致染色结果不准确。如涂片不均匀、脱色时间不一致等，都可能使革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的区分出现偏差。

3、革兰氏染色的意义

革兰氏染色是细菌学中重要的鉴别染色方法之一。通过革兰氏染色，可以快速区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，这对于细菌的初步分类和鉴定具有重要意义。不同类型的细菌对药物的敏感性不同，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在抗生素的选择上有很大差异。例如，青霉素对革兰氏阳性菌有较好的抗菌效果，而对革兰氏阴性菌效果较差。因此，革兰氏染色结果可以为临床治疗中合理选用抗生素提供参考依据。此外，在微生物学研究中，革兰氏染色也是进一步深入研究细菌生物