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演讲人：日期:单细胞扩增技术

CATALOGUE目录01技术概述02主要方法03应用领域04实验流程05数据分析06挑战与前景

01技术概述

基本定义与背景指从单个细胞中提取并扩增其基因组或转录组的技术，旨在解决传统群体细胞分析掩盖个体差异的问题，为研究细胞异质性提供高分辨率工具。单细胞扩增技术定义发展历程背景应用领域扩展起源于20世纪90年代的单细胞PCR技术，随着微流控、纳米技术和NGS的进步，逐步发展为涵盖全基因组扩增（WGA）和全转录组扩增（WTA）的体系。广泛应用于肿瘤学（如循环肿瘤细胞分析）、发育生物学（胚胎细胞分化研究）、神经科学（神经元多样性解析）及免疫学（T细胞受体库研究）。

通过多重置换扩增（MDA）或基于引物延伸的扩增技术（如MALBAC），对单细胞微量DNA进行非特异性扩增，覆盖率达90%以上，可检测拷贝数变异和单核苷酸突变。核心原理介绍全基因组扩增（WGA）原理采用模板转换技术（如Smart-seq2）或体外转录扩增，捕获单细胞mRNA并构建cDNA文库，实现低丰度转录本的高灵敏度检测。全转录组扩增（WTA）原理利用微孔芯片或液滴微流控系统（如10xGenomics）实现单细胞分离与并行扩增，提升通量和准确性，降低交叉污染风险。微流控技术整合

技术重要性分析揭示细胞异质性价值突破传统批量测序的局限性，解析同一组织中不同细胞的基因表达谱差异，为癌症克隆进化、干细胞分化等机制研究提供关键数据。临床诊断潜力在产前诊断中通过单细胞扩增检测胚胎染色体异常，在液体活检中实现稀有循环肿瘤细胞的基因组分析，推动精准医疗发展。技术瓶颈与突破方向当前存在扩增偏倚（如等位基因丢失）、覆盖不均等问题，未来需开发低偏差扩增酶和人工智能辅助的数据校正算法以提升可靠性。

02主要方法

PCR-based扩增技术多重置换扩增（MDA）利用Phi29DNA聚合酶的高保真性和链置换活性，实现全基因组无偏倚扩增，适用于低起始量DNA样本，但可能产生嵌合片段和扩增偏差。退火控制引物PCR（ACP）通过温度梯度控制引物特异性结合，减少非特异性扩增，显著提高单细胞基因组覆盖均匀性，尤其适用于拷贝数变异分析。微滴式数字PCR（ddPCR）将样本分割成数万纳升级微滴进行独立扩增，通过荧光信号统计绝对定量，在单细胞基因表达检测中具有极高灵敏度和准确性。

MDA扩增方法采用改良的缓冲体系与随机引物设计，将扩增偏倚降低至1.5倍以内，可实现单细胞水平90%以上的基因组覆盖度，满足体细胞突变检测需求。全基因组扩增优化线粒体DNA富集策略甲基化保留扩增通过针对性引物设计和酶切预处理，使线粒体基因组扩增效率提升20倍，为线粒体异质性研究提供可靠技术支撑。整合亚硫酸氢盐转化与MDA技术，在扩增过程中保持原始DNA甲基化模式，单细胞甲基化检测一致性达85%以上。

MALBAC扩增策略准线性预扩增机制表观遗传学联用平台单细胞转录组兼容方案通过特殊设计的引物实现有限循环的线性扩增，将基因组分割为1kb左右的片段后再进行指数扩增，将单细胞全基因组扩增偏差控制在10%以内。结合模板转换技术（SMART）与MALBAC原理，实现单细胞mRNA的全长扩增，基因检出率较传统方法提高40%，可检测低至0.1FPKM的表达量。整合MALBAC与染色质构象捕获技术（Hi-C），在单细胞水平同步获取基因组序列和三维结构信息，空间分辨率可达10kb级别。

03应用领域

癌症基因组研究肿瘤异质性解析通过单细胞扩增技术揭示肿瘤内部不同细胞亚群的基因表达差异，为精准治疗提供靶点筛选依据。循环肿瘤细胞检测捕获外周血中极低丰度的循环肿瘤细胞，扩增其基因组以研究转移潜能和克隆演化规律。耐药机制探索分析化疗或靶向治疗前后癌细胞的单细胞基因组变异，识别耐药相关基因突变及信号通路异常。

发育生物学应用干细胞分化建模通过单细胞多组学数据重建干细胞向特定谱系分化的轨迹，优化体外定向分化方案。器官形成机制构建高分辨率细胞图谱，揭示心脏、肝脏等器官发育中细胞类型特化的分子时序网络。细胞命运决定研究追踪胚胎发育过程中单个细胞的转录组动态变化，解析关键调控因子对细胞分化的影响。

神经科学探索神经元多样性鉴定扩增单个神经细胞的RNA，分类大脑皮层中兴奋性/抑制性神经元亚型及其功能特征。01突触可塑性分析比较学习记忆过程中突触相关基因在单神经元水平的表达变化，揭示神经环路重塑机制。02神经退行性疾病研究检测阿尔茨海默病等患者脑组织中的异常蛋白聚集与神经元转录组关联性，寻找早期干预靶点。03

04实验流程

单细胞分离步骤样本制备与预处理细胞活性检测单细胞分选技术组织样本需经过酶解或机械法分解为单细胞悬液，并通过过滤或梯度离心去除细胞团块和碎片，确保单细胞纯度。对于血液样本，可采用密度梯度离心法分离目标细胞群。利用流式细