基因工程第八章.pptVIP

每?gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法2.转化率简单，但转化效率不高（106-108/?gDNA）。（1）热休克法（heatshock）转化效率高（高于109/?gDNA）。（2）电转化法第29页，共49页，星期日，2025年，2月5日10ng载体DNA100?L感受态菌Onice混合，静置10分钟42oC1分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100?L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法第30页，共49页，星期日，2025年，2月5日LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300?L电转仪调为2.5kV,25?F脉冲控制器200-400?0.5?g质粒DNAOnice混合加入1mLSOC培养液37°C中速震荡60分钟10-100?L转化液涂含抗菌素的平板转化（2）电转化法第31页，共49页，星期日，2025年，2月5日4.平板培养基培养细菌10-100?L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜第32页，共49页，星期日，2025年，2月5日环形重组质粒质粒自我连接线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①环形质粒数（1）重组质粒5.影响转化率的因素第33页，共49页，星期日，2025年，2月5日①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。④储存感受态菌要在-70℃以下③CaCl2处理⑤使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞（competentcells)第34页，共49页，星期日，2025年，2月5日把重组的噬菌体?DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的?噬菌体颗粒。6.体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（invitropackaging）（2）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的?DNA接受器位点（receptorsite)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。第35页，共49页，星期日，2025年，2月5日基因工程第八章第1页，共49页，星期日，2025年，2月5日一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。第一节DNA片段的体外连接1.两段DNA的连接依靠粘性末端2.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端第2页，共49页，星期日，2025年，2月5日二、齐平末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’第3页，共49页，星期日，2025年，2月5日1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚加尾法2.人工加尾形成“粘性末端”DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补第4页，共49页，星期日，2025年，2月5日④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。第5页，共49页，星期日，2025年，2月5日用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接①linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用第6页，共49页，星期日，2025年，2月5日④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:③优点：第7页，共49页，星期日，2025年，2月5日（3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’GGCC-p5’BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。