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基于链接化学的辣根过氧化酶固载及直接电化学性能研究

一、引言

1.1研究背景与意义

辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase，HRP）是一种含铁卟啉作为强键合辅基的糖蛋白，分子量约为44000。由于其来源广泛、价格相对低廉、稳定性好，且在室温下能保持活性，成为商品化较早且应用极为广泛的一种酶制剂。自1845年HRP被首次用于测定过氧化氢的含量以来，其在众多领域展现出重要的应用价值。在分析检测领域，HRP是临床检验试剂中的常用酶，广泛用于多个生化检测项目以及免疫类（ELISA）试剂盒，作为显色体系的关键成分，对试剂盒的质量起着决定性作用。在有机合成领域，HRP能够催化多种底物的氧化反应，尤其是与过氧化氢反应生成自由基，进而催化其他化合物的氧化反应，推动有机合成反应的进行。在生物转化过程中，HRP凭借其独特的催化特性，实现生物分子的特定转化，为生物制药等领域提供了关键技术支持。在食品工业中，HRP也被用于食品的保鲜、品质检测等方面。

然而，游离的HRP在实际应用中存在诸多局限性。其稳定性在一些复杂环境下难以保证，容易受到温度、pH值、化学物质等因素的影响而失活，导致其催化效率下降，限制了其在更广泛条件下的应用。而且游离酶在反应体系中难以分离和回收，无法重复使用，这不仅增加了生产成本，还可能对环境造成一定的负担。为了克服这些问题，酶固定化技术应运而生。通过将HRP固定在特定的载体上，可以提高其稳定性，使其能够在更恶劣的环境中保持活性，同时便于回收和重复利用，降低生产成本。

HRP的直接电化学研究也具有重要意义。酶的直接电化学旨在实现酶与电极之间的直接电子转移，这一过程对于深入理解酶的催化机制、开发新型生物传感器和生物燃料电池等具有关键作用。HRP的氧化还原活性中心深埋在酶分子内部，其与电极表面间的距离超过了电子能以足够快的速率进行转移的距离，在通常情况下难以与电极之间进行直接电子转移。获得HRP直接电子转移反应良好伏安峰形的报道较少，这限制了对其电化学行为的深入研究以及相关应用的拓展。因此，开展HRP的直接电化学研究，探索实现其与电极有效电子转移的方法，对于揭示酶的催化本质、开发高性能的生物电化学装置具有重要的科学意义和实际应用价值。

1.2国内外研究现状

在辣根过氧化酶固载化的研究方面，近年来取得了显著进展。研究人员探索了多种载体用于HRP的固定化，其中纳米材料由于其特殊的结构和性质，如表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应，展现出独特的优势。纳米颗粒能够提供更大的比表面积，增加酶与载体的接触面积，从而提高酶的固载量。金纳米颗粒能和酶中的胺基和半胱氨酸残基紧密结合，将蛋白质吸附在金纳米颗粒上，有可能保持蛋白质的生物活性。张娟等将HRP固定在SiO?的纳米粒子上，利用SiO?纳米粒子高的表面能和良好的生物相容性，制得的HRP比用SiO?粉末吸附固定具有更高的生物活性。除了纳米材料，有序介孔有机硅（PMOs）也因其孔径规则可调、比表面积大且结构稳定，成为固定化酶载体的研究热点。高玲等人考查了HRP在新型有序介孔有机硅材料上的固定化情况，发现固定化后酶的催化活性得到了明显提高。

在固定化方法上，传统的吸附法、包埋法、共价结合法等仍然被广泛应用，但也存在一些问题。吸附法操作简单，但酶与载体的结合力较弱，容易脱落；包埋法对酶的活性影响较小，但传质阻力较大；共价结合法结合力强，但可能会对酶的活性中心造成破坏。为了克服这些问题，新的固定化方法不断涌现。分子自组装技术和链接化学相结合的方法为固载蛋白质提供了新途径，链接化学具有反应条件温和、产率高、生物兼容性好的特点，为研究新的表面修饰方法提供了极大的便利。

在辣根过氧化酶直接电化学的研究方面，众多学者致力于实现HRP与电极之间的有效电子转移。陈勇等人制备了十八烷基胺六方介孔二氧化硅（ODA-HMS）/辣根过氧化物酶（HRP）聚乙烯醇凝胶膜化学修饰电极，考察了HRP在裸玻碳电极上和ODA-HMS聚乙烯醇凝胶膜修饰电极上的直接电化学行为，发现通过吸附包埋法制备的修饰电极上，HRP可以呈现出良好的可逆的直接电化学行为。钟薇等人制备了考马斯亮蓝和多壁碳纳米管混合物修饰玻碳电极（CBBG250/MwNT/Gc），使辣根过氧化物酶在该电极上实现了稳定的直接电子转移反应，循环伏安图上出现了一对对称性良好的氧化还原峰。

现有研究仍存在一些不足。在固载化方面，部分固载化酶的活性和稳定性提升效果不够理想，需要进一步优化载体和固定化方法，以提高固载化酶的性能。在直接电化学研究中，实现HRP与电极之间高效、稳定的直接电子转移仍然面临挑战，需要探索新的电极材料和修饰方法，以改善电子转移