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双T-DNA载体系统：无选择标记转基因菊花培育的创新策略

一、引言

1.1研究背景

菊花（ChrysanthemummorifoliumRamat.）作为世界四大切花之一，是广泛应用于观赏、药用及食用的重要花卉。其花色丰富，花型多样，花期各异，具有极高的观赏价值，常被种植于花坛、花境、庭院等地，也可作为切花用于插花艺术，在花卉市场中占据重要地位。在药用方面，菊花具有散风清热、平肝明目、清热解毒的功效，对风热感冒、头晕目眩、目赤肿痛等症状有一定的缓解作用，被广泛应用于中医药领域。在食用上，菊花可用于制作菊花茶、菊花糕、菊花粥等美食，不仅口感独特，还具有一定的保健作用。

传统的菊花育种方法主要包括选择育种、杂交育种和诱变育种等。选择育种通过有意识地选择具有优良性状的个体进行繁殖，逐渐固定优良性状，但该方法要求对育种目标有明确的了解，且需要较长时间来固定性状，同时可能会导致基因多样性的减少。杂交育种利用两个或多个亲本的优势互补性对交配后代进行选择，虽然可以迅速将优良性状导入到新的杂交品种中，提高生产力和适应性，但要保持杂种优势，就需要不断进行亲本选育和重新杂交，成本较高。诱变育种利用辐射（如X射线、伽马射线等）诱变基因，产生大量变异体，其中可能包含具有改良性状的个体，然而变异体数量大且难以控制，部分变异可能是不可取的。

随着生物技术的发展，基因工程育种为菊花的品种改良提供了新的途径。基因工程育种通过将目的基因导入植物细胞，实现性状的定向改造，具有准确性高、速度快、效果明显的优点，可以迅速改良菊花的抗病性、耐逆性、花色、花型等性状。目前，常用的基因转化方法包括农杆菌介导转化和基因枪法等，其中农杆菌介导转化法因其操作简便、成本低、转化效率较高等优点而被广泛应用。

然而，在基因工程育种过程中，选择标记基因的使用虽然能够方便地筛选出转基因植株，但也带来了一系列隐患。在食品安全方面，抗性选择标记基因可能编码出对人体有直接毒性的蛋白质，或者编码出的蛋白质所具有的催化功能对宿主的代谢具潜在毒性作用，并可能出现滞后效应或长期效应。转基因植物还有可能会表达出过敏蛋白，有的基因表达出的蛋白质与已知的过敏蛋白质在免疫学上具有同源性，有的基因表达的蛋白质家族中的某些成员是过敏蛋白，这些都有可能使过敏体质的人产生过敏反应。在生物安全方面，载体介导的外源基因可能发生横向转移，重组出新的菌株或病毒。具有抗虫功能的转基因植物，其体内产生的抗虫蛋白可能使害虫产生抗性，使害虫变得更加难以防治。转基因植物还有可能会变成野生种类，或者侵入新的生态区域，破坏生态平衡后而成为杂草。这些问题限制了转基因菊花的商业化应用和推广。

为了解决选择标记基因带来的问题，利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因菊花成为了研究的热点。双T-DNA载体系统是将选择标记基因和目的基因分别构建在两个T-DNA区域，通过农杆菌介导转化，使两个T-DNA区域共转化进入植物细胞，在后代中通过遗传分离获得无选择标记的转基因植株。这种方法可以有效地避免选择标记基因带来的生物安全和食品安全隐患，为转基因菊花的培育和应用提供了新的思路和方法。

1.2研究目的与意义

本研究旨在利用双T-DNA载体系统，将目的基因导入菊花细胞中，通过农杆菌介导转化法获得转基因菊花植株，并通过遗传分离筛选出无选择标记的转基因菊花后代。具体来说，通过构建含有目的基因和选择标记基因的双T-DNA载体，利用农杆菌介导转化菊花的幼嫩茎尖薄层细胞，经过筛选和鉴定获得转基因菊花植株。对转基因植株进行自交或杂交，通过分子生物学检测方法，筛选出不含有选择标记基因但含有目的基因的转基因菊花后代。

本研究的意义主要体现在以下几个方面：从生态安全角度来看，避免了选择标记基因可能带来的生物安全风险，如基因漂移、对非目标生物的影响等，减少了转基因菊花对生态环境的潜在危害，有助于维护生态平衡。在食品安全层面，消除了消费者对选择标记基因可能对人体健康产生影响的担忧，提高了转基因菊花及其产品的安全性和可接受性，为转基因菊花在食用和药用领域的应用奠定了基础。在农业可持续发展方面，为菊花的基因工程改良提供了一种安全、有效的技术手段，有助于培育出具有优良性状的菊花新品种，提高菊花的产量和品质，减少农药和化肥的使用，促进农业的可持续发展。从技术创新角度出发，本研究探索了双T-DNA载体系统在菊花转基因中的应用，为其他植物的无选择标记转基因研究提供了参考和借鉴，推动了植物基因工程技术的发展。

1.3国内外研究现状

在国外，双T-DNA载体系统在植物转基因研究中得到了广泛的应用。早期，研究人员利用双T-DNA载体系统在烟草中进行共转化实验，成功获得了无选择标记的转基因烟草植株，证明了该方