紫花苜蓿再生体系构建及农杆菌介导BADH基因转化的关键技术与应用研究.docxVIP

紫花苜蓿再生体系构建及农杆菌介导BADH基因转化的关键技术与应用研究

一、引言

1.1研究背景与意义

紫花苜蓿（MedicagosativaL.）作为世界上最重要的豆科牧草之一，享有“牧草之王”的美誉，具有极高的经济价值与生态价值。在经济价值方面，紫花苜蓿是优质的饲料作物，其含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质等营养成分，能够显著提升家畜的生长性能和产品质量，在畜牧业中应用广泛。同时，因其营养价值高，还被开发成苜蓿茶、苜蓿粉等人类食品，深受市场欢迎。此外，紫花苜蓿还是重要的蜜源植物，可生产高品质蜂蜜，进一步增加了其经济价值。从生态价值来看，紫花苜蓿根系发达，固氮能力强，能够有效增加土壤中的氮素含量，改良土壤结构，提高土壤肥力，减少化学肥料的使用量；还能抑制杂草生长，减少农药施用量，对保护生态环境意义重大；并且可以保持水土，防止水土流失，特别是在坡地种植时效果更为明显，还有助于增加生物多样性，为许多有益昆虫提供栖息地，促进生态平衡。

然而，紫花苜蓿的生长常受到干旱、盐碱等非生物胁迫的严重影响。盐碱土壤中过高的盐分浓度会干扰紫花苜蓿对水分和营养的摄取，导致植株生长受限、叶片干燥和黄化等现象；严重干旱会导致土壤水分不足，限制其根系生长和水分吸收能力，影响植株健康和生长速度。据统计，全球约有20%的耕地和50%的灌溉地受到不同程度的盐渍化影响，干旱地区的面积也在不断扩大，这些不利环境因素极大地限制了紫花苜蓿的种植范围和产量，制约了其在畜牧业和生态环境建设中作用的充分发挥。

随着生物技术的发展，基因工程为提高紫花苜蓿的抗逆性提供了新途径。甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因在植物耐盐耐旱过程中发挥着关键作用。BADH能够催化甜菜碱醛生成甜菜碱，甜菜碱作为一种重要的渗透调节物质，可帮助植物维持细胞内的渗透压平衡，保护细胞免受水分胁迫的伤害；还能增强植物的抗氧化能力，清除体内产生的活性氧，减轻氧化应激对细胞的损伤，从而提高植物在盐碱和干旱等逆境条件下的生存能力。通过农杆菌介导将BADH基因转化到紫花苜蓿中，有望培育出耐盐耐旱的紫花苜蓿新品种，这对于扩大紫花苜蓿的种植范围，提高其在逆境条件下的产量和品质，促进畜牧业发展以及改善生态环境具有重要的现实意义。

1.2国内外研究现状

紫花苜蓿再生体系的建立是基因转化的基础。自20世纪70年代初，国外就从苜蓿的愈伤组织成功诱导出了植株，开启了苜蓿再生体系研究的序幕。此后，关于苜蓿再生体系的研究不断深入，在再生途径、品种基因型、外植体、基本培养基、生长调节物质及其他添加物的应用等方面均取得了一定进展。目前已知苜蓿的再生途径主要包括直接分化芽再生途径和通过愈伤组织再生途径。直接分化芽再生途径转化频率较低，易产生嵌合体，但再生周期短、遗传变异小；通过愈伤组织再生途径相对较为常用，然而不同品种基因型对再生能力有显著影响，混合型优势明显的品种再生率较高，单倍体则较难利用。在选择外植体时，茎尖、叶片、幼嫩愈伤组织、下胚轴、子叶节等都有应用，不同外植体的愈伤组织诱导率和分化效果存在差异。MS、B5、WPM等培养基在苜蓿再生体系中均有使用，其中MS培养基最为常用，且不同生长阶段对培养基成分和比例的要求有所不同。多种激素的组合，如NAA和BA、2,4-D和6-BA等，被用于诱导再生体系，不同激素浓度配比会影响再生的质与量。此外，对幼嫩愈伤组织进行低温处理、暴露光照等预处理，可提高诱导再生能力。

在紫花苜蓿基因转化方面，农杆菌介导法是目前应用最广泛且技术最成熟的途径之一。早在1986年，Deak和Webb就分别通过农杆菌转化法成功地将nptII基因导入苜蓿，并获得了抗性植株，但早期转化效率较低。此后，众多研究致力于优化农杆菌介导的遗传转化体系，对影响转化效率的各种因素进行了深入研究，包括抗菌素和筛选抗生素的浓度、基因型、外植体类型和生理状态、农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间以及乙酰丁香酮等诱导物的使用等。例如，有研究确定了Cef最适浓度为400mg/L，Kan最适浓度为50mg/L；发现基因型为WL-323、外植体为下胚轴时转化效率较高；适宜的菌液浓度OD600值为0.3-0.5，侵染时间15-20分钟，无预培养，共培养3-4天，在农杆菌液体培养基及共培养基中都加入乙酰丁香酮（10mg/L）时侵染效率较高。除农杆菌介导法外，基因枪法、花粉管通道法等也在紫花苜蓿基因转化中有所应用，但这些方法存在操作复杂、成本高或转化效率不稳定等问题。

尽管国内外在紫花苜蓿再生体系建立和基因转化方面取得了诸多成果，但仍存在一些不足。例如，目前建立的再生体系和遗传转化体系大多针对特定品种或基因型，缺乏广泛的适用性；转化效率仍有待进一