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基于SSH技术解析犬小孢子菌在不同诱导底物下的基因表达差异与致病关联

一、引言

1.1研究背景与目的

犬小孢子菌病是一种常见的皮肤真菌病，主要由亲动物性的犬小孢子菌感染引起。近年来，随着人们生活水平的提高和饲养宠物的流行，犬小孢子菌病的发病率呈逐年上升趋势。这种疾病不仅影响宠物的健康，还会通过直接接触或间接接触传播给人类，尤其是儿童和免疫功能低下的人群，给公共卫生带来了一定的威胁。

犬小孢子菌的致病机制较为复杂，涉及多个基因的表达和调控。目前，对于犬小孢子菌在不同诱导底物下的基因表达差异研究较少，这限制了我们对其致病机制的深入理解。抑制性消减杂交（SSH）技术是一种高效分离差异表达基因的方法，具有特异性高、假阳性率低、操作简便等优点。本研究旨在利用SSH技术，构建犬小孢子菌在不同诱导底物下的差异表达基因文库，筛选和鉴定差异表达基因，为揭示犬小孢子菌的致病机制提供理论依据，同时也为犬小孢子菌病的防治提供新的靶点和思路。

1.2犬小孢子菌概述

犬小孢子菌属于真菌界、子囊菌门、粪壳菌纲、肉座菌目、小孢子菌属，是一种嗜角质性真菌。其菌丝有隔，呈分枝状，可产生大分生孢子和小分生孢子。大分生孢子呈纺锤形，壁厚，表面有刺状突起，通常含有6个以上的分隔；小分生孢子呈棍棒状，数量较少。犬小孢子菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）上生长迅速，菌落初为白色至黄色绒毛样，2周后菌丝增多，呈羊毛状，中央趋向粉末化，表面呈黄白色，有少数同心圆，背面红棕色，中央部显著，边缘部较浅。

犬小孢子菌主要通过直接接触感染的动物或被污染的物品传播，如宠物的毛发、皮屑、毛巾、梳子等。人类感染犬小孢子菌后，主要引起头癣、体癣、脓癣等浅部真菌病，少数情况下可引起甲癣。头癣多见于儿童，表现为头皮出现白色鳞屑斑，逐渐扩大，头发易折断，严重时可导致永久性脱发；体癣好发于面部、颈部、躯干和四肢，表现为环形或圆形的红斑，边缘隆起，中央自愈，伴有瘙痒；脓癣则表现为头皮或其他部位出现脓肿，疼痛明显，可伴有发热等全身症状。

1.3SSH技术原理及在基因研究中的应用

SSH技术是1996年由Diatchenko等在抑制性PCR的基础上建立起来的cDNA消减杂交方法。其基本原理是利用杂交二级动力学原理和抑制性PCR技术，将实验组（tester）和对照组（driver）的mRNA逆转录成cDNA，用识别四碱基序列的限制性内切酶RsaI消化后，使长链cDNA片段化。将testercDNA分成均等的两份，分别连接不同的接头，然后与过量的drivercDNA进行两轮杂交。在第一轮杂交中，由于丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链cDNA，使得原来在丰度上有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致；第二轮杂交进一步富集差异表达的cDNA。杂交产物经两轮PCR扩增，最终得到差异表达的cDNA片段。

SSH技术具有诸多优点，如对高、低丰度的差异表达基因都能有效分离；操作简便易行，所采用的技术方法简单、成熟，易掌握；灵敏度高，仅需1-2μg的mRNA；重复性好，阳性率高达94%；速度快，一般3-4天即可获得差异表达基因片段的cDNA。因此，SSH技术在基因研究中得到了广泛应用。例如，在鳗弧菌的研究中，利用SSH技术成功鉴定了不同致病性的鳗弧菌菌株的基因差异及潜在的毒力基因；在细粒棘球蚴的研究中，应用SSH技术构建了H2O2胁迫下细粒棘球蚴与正常组织差异表达的消减cDNA文库，为研究细粒棘球蚴在抗氧化过程中的相关靶基因筛选奠定了基础。这些研究表明，SSH技术在分离和鉴定生物的差异表达基因方面具有重要的应用价值，为深入了解生物的生理过程和致病机制提供了有力的工具。

二、材料与方法

2.1实验材料

犬小孢子菌菌株（临床分离株，由[医院名称]皮肤科实验室保存提供）。儿童头皮组织、儿童光滑皮肤组织（均取自[医院名称]皮肤科门诊确诊为犬小孢子菌病的患儿，在征得患儿家长知情同意后，于手术或换药过程中无菌采集），成人头皮组织（取自[医院名称]健康志愿者，在征得志愿者知情同意后，无菌采集）。

沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、米饭培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），均购自[培养基生产厂家]；RNA提取试剂盒（[品牌名称]）、逆转录试剂盒（[品牌名称]）、Trizol试剂（[品牌名称]）、限制性内切酶RsaI、T4DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs等分子生物学试剂，均购自[试剂生产厂家]；pGEM-TEasyVector克隆载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞，购自[生物公司]；尼龙膜（[品牌名称]）、地高辛标记试剂盒（