HPSH_05790真核表达质粒的构建及其生物学效应的初步观察.docxVIP

HPSH_05790真核表达质粒的构建及其生物学效应的初步观察

一、引言

在分子生物学研究领域，真核表达质粒的构建是探究基因功能的关键技术手段。HPSH_05790基因作为近年来新发现的潜在功能基因，其在真核生物体内的作用机制尚未明确。本研究旨在通过基因克隆技术构建HPSH_05790真核表达质粒，并初步观察其在靶细胞中的生物学效应，为后续深入解析该基因的功能奠定基础。

二、材料与方法

（一）实验材料

菌株与载体：大肠杆菌DH5α感受态细胞、真核表达载体pcDNA3.1(+)（含CMV启动子和His标签）；

基因模板：HPSH_05790基因cDNA模板（由实验室前期克隆获得）；

工具酶与试剂：限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ（ThermoScientific）、T4DNA连接酶（NEB）、质粒提取试剂盒（天根生化）、Lipofectamine3000转染试剂（Invitrogen）；

靶细胞：人胚肾细胞HEK293T（实验室常规培养）。

（二）HPSH_05790真核表达质粒的构建

引物设计与PCR扩增：根据HPSH_05790基因CDS区序列及pcDNA3.1(+)载体多克隆位点，设计含EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的特异性引物（上游引物：5-CGGAATTCATGAGTCTGAAGCTGCTG-3；下游引物：5-CCGCTCGAGTTAGTCGTCGTCCTTGTAG-3）。以cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。

酶切与连接：将PCR产物与pcDNA3.1(+)载体分别用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切（37℃孵育4h），经琼脂糖凝胶电泳回收目的片段与载体骨架。用T4DNA连接酶将目的片段与载体按3:1比例连接（16℃孵育过夜），构建重组质粒pcDNA3.1-HPSH_05790。

转化与鉴定：将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基，37℃培养12-16h。挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，阳性菌落提取质粒后进行双酶切验证，同时送测序公司进行基因序列测定（确保无碱基突变或移码）。

（三）生物学效应初步观察

细胞转染：将对数生长期的HEK293T细胞接种于6孔板（2×10?细胞/孔），培养至细胞融合度达70%-80%时，按Lipofectamine3000说明书进行转染：实验组转染pcDNA3.1-HPSH_05790，对照组转染空载体pcDNA3.1(+)，空白组不进行转染。

蛋白表达验证：转染48h后，收集各组细胞，提取总蛋白，采用Westernblot检测HPSH_05790蛋白表达（一抗为His标签特异性抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG），以β-actin为内参。

细胞增殖检测：转染24h、48h、72h后，采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性：每孔加入10μLCCK-8试剂，37℃孵育2h，用酶标仪测定450nm处吸光度值（OD值），以OD值反映细胞增殖能力。

细胞凋亡检测：转染48h后，收集各组细胞，用AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒染色，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率，分析HPSH_05790对HEK293T细胞凋亡的影响。

三、结果

（一）HPSH_05790真核表达质粒构建结果

PCR扩增结果：琼脂糖凝胶电泳显示，PCR产物在约1200bp处出现特异性条带（与HPSH_05790基因CDS区理论长度一致），无杂带，表明目的片段扩增成功。

酶切与测序验证：重组质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，电泳显示两条清晰条带（载体骨架约5.4kb，目的片段约1200bp）；测序结果与HPSH_05790基因参考序列完全一致，证明pcDNA3.1-HPSH_05790真核表达质粒构建成功。

（二）生物学效应初步观察结果

蛋白表达：Westernblot结果显示，实验组可检测到约45kDa的特异性条带（HPSH_05790-His融合蛋白），对照组与空白组无该条带，表明HPSH_05790蛋白在HEK293T细胞中成功表达。

细胞增殖：CCK-8检测结果显示，与对照组和空白组相比，实验组在转染48h、72h后OD值显著降低（P0.05），提示HPSH_05790过表达可抑制HEK293T细胞增殖。

细胞凋亡：流式细胞仪检测结果显示，实验组