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苹果梨果皮花青苷合成相关基因的克隆与表达特性研究

一、引言

1.1研究背景与意义

苹果梨（PyrusbretschneideriRehd.‘Pingguoli’）属蔷薇科梨属植物，最初由朝鲜引入我国延边地区。其果大、抗寒，果皮阳面着红晕，口感甘甜、酥脆、多汁，深受消费者喜爱，在市场上具有很高的经济价值，是北方地区的名贵果品。常食用苹果梨可止咳化痰、利尿、促进代谢等，含有多种人体必需营养素，营养学家认为它是“保健食品”和“功能食品”。目前，龙井市作为苹果梨的发源地，其苹果梨种植面积达到4.5万亩，已发展果树农民合作组织33家，并且该市着力发展苹果梨深加工产业，相继推出了苹果梨醋、苹果梨汁、果酱、果脯、果膏、苹果梨米酒及白酒等一系列产品，有效延续了苹果梨产业生命周期。

近年来，随着消费者对水果品质和外观要求的不断提高，红皮梨在市场上越来越受到追捧。红皮梨不仅颜色鲜艳，还具有果肉细腻、汁水丰富、甜度适中的特点，如著名的红星梨和红香酥梨等，在国内外市场上都具有较高的竞争力。开发红梨资源，培育红梨新品种成为我国梨树育种研究的重要方向。苹果梨作为一种本身果皮阳面能着红晕的品种，对其果皮花青苷合成相关基因进行研究，有助于深入了解花青苷合成的分子机制。这不仅能够为培育色泽更鲜艳、品质更优良的红皮梨新品种提供理论依据，还可以通过调控基因表达，改善苹果梨的外观品质，提高其市场价值，满足消费者对高品质水果的需求，进一步推动梨产业的发展。

1.2苹果梨果皮花青苷研究现状

苹果梨是1921年从朝鲜引入，通过嫁接、培育、繁殖、引栽而成的地方品种，具有酸甜爽口、抗寒性强等特点，是世界上罕见的能着红色的大果梨品种，在自然条件下果实可以着红晕。果实果皮着色的深浅由花青苷积累的含量和分布情况决定，果皮的色泽程度与果皮中含有的叶绿素、类胡萝卜素、花青素等多种色素的多少有关，是多种色素共同作用的结果。

目前，对于苹果梨的研究，在套袋苹果梨解袋前后果皮着色相关基因方面已经取得了不少成绩。孙百灵等利用RT-PCR技术对套袋苹果梨果实着色关键酶PAL、CHI、UFGT基因片段进行了克隆及表达分析；王旭以套袋苹果梨为试材，克隆了影响苹果梨着色相关酶PAL、CHS基因全长，并构建了PAL基因的植物表达载体；刘振坤采用RT-PCR技术成功克隆出了影响苹果梨果皮着红色的关键酶基因CHI和F3H并做了相关生物信息学分析。花色素合成酶（ANS）是花色素苷生物合成途径后期的关键酶之一，王雪等人对苹果梨ANS基因cDNA全长序列进行克隆，并对其表达模式和表达产物进行分析，结合荧光定量PCR技术分析不同处理下以及不同采果时期，苹果梨果皮中ANS的表达模式及其生物信息学特性，发现PyANS基因受到光诱导表达量迅速上升，与果实着色和花色苷含量测定的结果相对应，表明PyANS基因对果实花色素苷积累有一定的促进作用。在转录因子方面，鹿艳新等以延边“苹果梨”果实为试材，克隆花青苷合成途径中的调控基因MYB114，并进行生物信息学分析，发现PyMYB114基因与白梨的MYB114基因核酸序列的相似性高达99％，为进一步探明“苹果梨”着色分子机理奠定基础。然而，对于苹果梨果皮花青苷合成相关基因的研究仍不够全面和深入，众多基因之间的相互作用以及它们在花青苷合成过程中的精细调控机制尚不完全清楚。

1.3研究目的与内容

本研究旨在通过对苹果梨果皮花青苷合成相关基因的克隆与表达分析，深入探究花青苷合成的分子机制，为培育红皮梨新品种和提高苹果梨果实品质提供理论依据和技术支持。具体研究内容如下：

苹果梨果皮花青苷合成相关基因的克隆：运用同源克隆、RACE等技术，克隆苹果梨果皮花青苷合成途径中的关键结构基因和调节基因，如CHS、CHI、F3H、ANS、UFGT以及MYB、bHLH、WD40等转录因子基因，获得其全长cDNA序列。

基因序列分析：对克隆得到的基因序列进行生物信息学分析，包括开放阅读框（ORF）预测、氨基酸序列推导、蛋白质理化性质分析、保守结构域预测、同源性分析以及系统进化树构建等，了解基因的结构特征和进化关系。

基因表达分析：采用实时荧光定量PCR技术，分析花青苷合成相关基因在苹果梨不同生长发育时期、不同组织部位以及不同处理条件下（如光照、温度、激素处理等）的表达模式，明确基因表达与花青苷积累的相关性。

基因功能验证：构建基因过表达载体和RNA干扰载体，通过遗传转化技术，将其导入苹果梨愈伤组织或模式植物中，观察转基因材料中花青苷含量和相关表型的变化，验证基因在花青苷合成中的功能。

二、材料与方法

2.1实验材料

本研究选取的苹果梨品种为延边苹果梨，主产于吉林省