猪瘟抗体阻断ELISA检测方法的建立和对猪瘟活疫苗免疫效果的评价.docxVIP

猪瘟抗体阻断ELISA检测方法的建立和对猪瘟活疫苗免疫效果的评价

一、引言

猪瘟（ClassicalSwineFever,CSF）是由猪瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus,CSFV）引起的一种高度接触性、致死性传染病，对全球养猪业造成巨大经济损失。疫苗免疫是防控猪瘟的关键手段，而准确评估猪群免疫后的抗体水平，是判断疫苗免疫效果、制定合理免疫程序的核心依据。传统血清学检测方法如中和试验（VNT）虽特异性强，但操作复杂、耗时较长，难以满足大规模临床检测需求。抗体阻断ELISA因具有快速、灵敏、高通量的优势，成为猪瘟抗体监测的理想技术。本研究旨在建立一种高效的猪瘟抗体阻断ELISA检测方法，并应用该方法系统评价猪瘟活疫苗的免疫效果，为猪瘟的科学防控提供技术支撑。

二、猪瘟抗体阻断ELISA检测方法的建立

（一）实验材料

抗原与抗体：重组CSFVE2蛋白（作为包被抗原，纯度≥95%）、鼠抗CSFVE2单克隆抗体（特异性识别E2蛋白保守表位，效价1:10000）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG二抗（购自Sigma公司，工作浓度1:5000）。

样本与试剂：猪瘟阴性血清（经VNT验证，抗体效价＜1:4）、猪瘟阳性标准血清（VNT效价1:128）、ELISA包被液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）、封闭液（5%脱脂奶粉-PBST）、洗涤液（PBST，含0.05%Tween-20）、底物液（TMB显色液）、终止液（2mol/LH?SO?）。

仪器设备：酶标仪（Bio-TekELx800）、移液器（Eppendorf）、恒温培养箱、离心机等。

（二）方法建立关键步骤

包被抗原浓度与抗体稀释度优化

采用棋盘滴定法确定最佳包被抗原浓度和单克隆抗体稀释度：将重组E2蛋白用包被液稀释为0.5、1.0、2.0、4.0μg/mL，分别加入酶标板（100μL/孔），4℃包被过夜；次日用PBST洗涤3次，5%脱脂奶粉37℃封闭1h；随后加入不同稀释度（1:500、1:1000、1:2000、1:4000）的鼠抗E2单克隆抗体（同时设阴性、阳性血清对照），37℃孵育1h；洗涤后加入HRP二抗，37℃孵育30min；TMB显色15min，终止后测定OD?50nm值。以“阳性血清OD值/阴性血清OD值（P/N）≥2.1且阳性OD值接近1.0”为标准，确定最佳包被浓度为2.0μg/mL，单克隆抗体最佳稀释度为1:2000。

反应条件优化

封闭时间：分别测试30min、1h、1.5h、2h的封闭效果，结果显示1h封闭可有效降低非特异性结合，且不影响特异性反应。

孵育温度与时间：对比37℃（30min、1h、1.5h）和室温（2h）的孵育效果，确定单克隆抗体与血清样本的孵育条件为37℃1h，二抗孵育条件为37℃30min。

底物显色时间：测试5、10、15、20min的显色效果，15min时阳性与阴性样本OD值差异最大，故选择15min为最佳显色时间。

方法验证

特异性：检测猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病（PR）阳性血清，均无交叉反应，特异性达100%。

敏感性：将猪瘟阳性标准血清（VNT效价1:128）倍比稀释，该方法可检出最低稀释度为1:256，敏感性显著高于传统VNT（1:128）。

重复性：对同一批样本进行批内（n=10）和批间（n=3）重复检测，变异系数（CV）均＜10%，重复性良好。

三、猪瘟活疫苗免疫效果的评价（基于建立的阻断ELISA方法）

（一）实验设计

实验动物：选择30日龄健康仔猪40头，经PCR检测CSFV阴性、阻断ELISA检测抗体阴性（OD?50nm＞0.8），随机分为2组：

免疫组（n=30）：肌肉注射猪瘟活疫苗（细胞源，含量≥10?.?TCID??/头份）；

对照组（n=10）：肌肉注射等量生理盐水。

采样时间：分别于免疫前（0d）、免疫后7d、14d、21d、28d、35d采集静脉血，分离血清，用于抗体检测。

攻毒保护试验（验证抗体与保护力的相关性）：免疫后28d，选取免疫组10头、对照组10头，肌肉注射CSFV强毒（石门株，10?TCID??/头份），观察14d，记录临床症状及死亡率，同时检测攻毒后7d血清中CSFV载量（RT-PCR）。

（二）免疫效果评价指标与结果

抗体阳性率与抗体水平动态变化

免疫前：两组仔猪抗体均为阴性；

免疫后7d：免疫组抗体阳性率为30%（9/30），平均OD?50n