液相色谱仪培训课件下载.pptVIP

液相色谱仪培训课件

第一章液相色谱基础理论

色谱的奥秘：分离的艺术色谱分离原理色谱技术利用混合物中各组分在固定相与流动相之间的分配系数差异,实现高效分离。当流动相携带样品通过色谱柱时,不同组分因与固定相的相互作用强度不同而被分离开来。这种分离过程可以持续重复成千上万次,每一次都增强了分离效果,这就是色谱技术如此强大的原因。生动的比喻液相色谱如同一条河流：流动相就像流动的河水,推动样品前进固定相如同河床上的石头,对不同物质有不同的吸附能力有些物质轻盈快速通过,有些则被石头暂时留住

液相色谱的分类与应用反相色谱最常用模式,固定相为非极性(如C18),流动相为极性溶剂。适合分离大多数有机化合物,包括药物、天然产物等。正相色谱固定相为极性(如硅胶),流动相为非极性溶剂。适合分离极性化合物和异构体,如糖类、维生素等。离子交换色谱利用离子交换作用分离带电物质。广泛应用于蛋白质、核酸、氨基酸等生物大分子的分离纯化。尺寸排阻色谱根据分子大小进行分离,又称凝胶色谱。主要用于聚合物、生物大分子的分子量测定和分离。

色谱柱与固定相详解C18柱(十八烷基)应用最广泛的反相柱,疏水性最强。适合分离中等到强疏水性化合物,如药物、农药残留、环境污染物等。C8柱(辛烷基)疏水性弱于C18,保留较弱。适合分离极性较强的化合物,或需要较快洗脱的样品分析。氨基柱极性固定相,用于正相色谱。特别适合分离糖类、碳水化合物及其他强极性化合物。氰基柱中等极性,可用于正相或反相模式。适合分离异构体、几何异构体等难分离化合物。

流动相的选择与优化有机溶剂的选择反相色谱常用甲醇和乙腈作为有机相：甲醇：洗脱能力较弱,粘度低,适合常规分析乙腈：洗脱能力强,UV截止波长低,适合高灵敏度检测四氢呋喃：特殊应用,溶解能力强缓冲液系统控制流动相pH值对分离至关重要。常用缓冲液包括磷酸盐、乙酸盐、甲酸等,浓度通常在10-50mM之间。洗脱模式对比等度洗脱流动相组成保持恒定。优点：基线稳定,重现性好,方法简单适用：样品组分极性相近,峰容量要求不高梯度洗脱流动相组成按程序变化。优点：可分离极性差异大的复杂样品,缩短分析时间适用：复杂基质,宽极性范围样品流动相优化是方法开发的核心环节。需要在保留、分离度、峰形和分析时间之间找到最佳平衡点。通常从文献方法出发,根据实际样品特性进行微调。

色谱图与关键术语解析01保留时间(RetentionTime,tR)从进样到峰顶出现的时间,是化合物的特征参数。保留时间的稳定性是定性分析的基础。02峰面积(PeakArea)色谱峰与基线围成的面积,与样品浓度成正比。定量分析的核心参数,积分准确性直接影响结果可靠性。03分离度(Resolution,Rs)衡量两个相邻峰分离程度的参数。Rs≥1.5表示基线分离,Rs=1.0为可接受分离。分离度是评价色谱方法的关键指标。04理论塔板数(N)表征色谱柱效能的参数,数值越高表示柱效越好。典型的分析柱理论塔板数在5000-20000之间。色谱图解读技巧：优秀的色谱图应具有平稳的基线、尖锐对称的峰形、良好的分离度以及合理的保留时间范围。任何异常都可能提示系统问题或方法需要优化。

色谱柱内部填料示意图色谱柱内部填充有高度均匀的球形颗粒(通常3-5微米),这些颗粒表面经过化学修饰形成固定相。流动相在颗粒间的孔隙中流动,样品分子在两相之间不断分配,实现分离。颗粒的粒径、孔径和表面化学性质共同决定了色谱柱的分离性能。

第二章液相色谱仪核心组成液相色谱仪是一个精密的分析系统,由多个模块协同工作。理解每个组件的功能和工作原理,是正确操作和维护仪器的基础。

输液泵：系统的心脏高压泵的关键作用输液泵是液相色谱仪最核心的部件,负责以恒定、精确的流速输送流动相通过整个系统。现代HPLC泵能够产生高达400bar的压力,确保流动相克服色谱柱的阻力稳定流动。往复式柱塞泵最常用类型,通过柱塞往复运动输送液体。双柱塞设计可以有效减少脉动,提供更稳定的流速。流速稳定性影响流速波动会导致保留时间不稳定、峰面积重现性差。优质泵的流速精度可达±0.1%,这是高质量分析的保证。泵维护要点：定期更换泵密封圈和单向阀,使用高纯度溶剂,避免盐析和微生物生长。每次使用后用水冲洗泵头,防止缓冲盐结晶堵塞。

进样器：精准引入样品手动六通阀原理六通阀有两个位置：Load位置用于进样品到定量环,Inject位置将定量环切入流路。这种设计实现了在高压下精确、重复的进样。自动进样器优势大幅提高通量和重现性,可无人值守运行。现代自动进样器配备温控功能,保持样品稳定性,进样精度可达RSD0.5%。定量环与进样技巧定量环容量选择：5-20μL：痕量分析、高浓度样品20-100μL：常规分析100μL：制备色谱进样体积应略大于定量环容量的2-3倍,确保定量环完全充满。使