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烟草△9-硬脂酰-ACP脱氢酶（SAD）基因的克隆、特征分析与功能验证

一、引言

1.1研究背景与意义

烟草（NicotianatabacumL.）作为一种重要的经济作物，在全球农业经济中占据着重要地位。然而，烟草的生长发育极易受到各种生物和非生物胁迫的影响，如低温、干旱、病虫害等，这些胁迫不仅降低了烟草的产量，还影响了其品质。脂肪酸作为植物细胞膜的重要组成成分，其组成和含量的变化对植物的抗逆性和品质有着重要影响。

△9-硬脂酰-ACP脱氢酶（SAD，EC.）是植物脂肪酸合成代谢途径中的关键酶，它催化硬脂酰-ACP（18:0-ACP）脱饱和，在脂肪酸链的C9-C10间引入一个双键，形成油酰-ACP（18:1-ACP），从而决定着植物饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例。在植物响应温度变化、增强低温适应性方面，SAD起着至关重要的作用。当植物受到低温胁迫时，SAD活性增强，促使饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸转化，增加细胞膜中不饱和脂肪酸的含量，从而提高细胞膜的流动性和稳定性，增强植物的抗寒能力。SAD还参与植物的防御、膜形成等生理过程，对植物的生长发育和生存具有重要意义。

对烟草SAD基因的研究，有助于深入了解烟草脂肪酸代谢的分子机制，为通过基因工程手段改良烟草的抗逆性和品质提供理论基础。通过调控SAD基因的表达，可以改变烟草中脂肪酸的组成和含量，进而提高烟草对低温、干旱等非生物胁迫的耐受性，减少病虫害的发生，提高烟草的产量和品质。研究烟草SAD基因还可以为其他植物的脂肪酸代谢研究提供参考，推动植物基因工程和分子育种的发展。

1.2国内外研究现状

在国外，对SAD基因的研究起步较早。早在1990年，James和Dooner就从植物种子中发现了fab2突变体，该突变体中的硬脂酸含量比野生型高2-3倍，这一发现为SAD基因的功能研究奠定了基础。随后，Ligh-tner等在1994年发现fab2突变体可以积累C18:0并且降低C18:1的含量。2007年，Kachroo等对拟南芥的基因组进行分析，发现了7个SAD的同型基因，这些基因不仅具有组织表达特异性和区域化特征，而且还具有不同的底物特异性，同时AtFAB2负责油酸的合成，具有转录后调控表达的特点，与其它的SAD具有复杂的相互作用，表现出精确的调控机制。在烟草SAD基因研究方面，国外学者已经克隆出了烟草的SAD基因，并对其序列和结构进行了分析，发现烟草SAD基因与其他植物的SAD基因具有较高的同源性。

在国内，对SAD基因的研究也取得了一定的进展。张党权等在2008年从油茶中克隆及解析了SAD的主要功能，为油茶的品质改良提供了理论依据。贾艳丽等在2014年对甘蓝型油菜的SAD基因进行了研究，发现该基因的表达与油菜的抗寒性密切相关。在烟草SAD基因研究方面，国内学者也开展了相关工作，如通过RT-PCR等技术克隆烟草SAD基因，并对其在不同组织和不同胁迫条件下的表达模式进行了分析。

尽管国内外在烟草SAD基因研究方面取得了一定的成果，但仍存在一些不足和空白。目前对烟草SAD基因的功能研究还不够深入，对其在脂肪酸代谢调控网络中的作用机制以及与其他基因的相互作用关系还了解甚少。在利用SAD基因改良烟草抗逆性和品质方面，虽然已经开展了一些转基因研究，但仍面临着转化效率低、基因表达不稳定等问题。因此，进一步深入研究烟草SAD基因的克隆与功能，对于揭示烟草脂肪酸代谢的分子机制，提高烟草的抗逆性和品质具有重要的理论和实践意义。

1.3研究目标与内容

本研究旨在深入探究烟草SAD基因的特性与功能，为烟草品质改良和抗逆性提升提供坚实的理论依据与技术支持。具体研究目标和内容如下：

烟草SAD基因的克隆：运用RT-PCR技术，从烟草中成功克隆出SAD基因，获取其完整的编码序列。通过对克隆得到的基因进行测序和序列分析，明确其核苷酸组成、开放阅读框以及与其他植物SAD基因的同源性，为后续的功能研究奠定基础。

烟草SAD基因的生物信息学分析：借助生物信息学工具，对烟草SAD基因编码的蛋白质进行全面分析。预测蛋白质的理化性质，包括分子量、等电点、氨基酸组成等；分析蛋白质的二级结构和三级结构，了解其空间构象；构建系统进化树，探究烟草SAD基因与其他植物SAD基因的进化关系，揭示其在进化过程中的保守性和特异性。

烟草SAD基因的表达模式分析：采用实时荧光定量PCR技术，系统研究烟草SAD基因在不同组织（根、茎、叶、花、种子等）和不同发育时期（苗期、生长期、开花期、成熟期等）的