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猪氨基肽酶在MDCK细胞中的异源表达与精准鉴定研究

一、引言

1.1研究背景与意义

在病毒学研究领域，深入探究病毒与宿主细胞之间的相互作用机制始终是一个核心课题，这对于理解病毒的感染过程、致病机理以及研发有效的防控策略具有不可替代的关键作用。而在这一过程中，明确病毒的细胞受体则是至关重要的基础环节。冠状病毒作为一类在医学和兽医学领域都具有重大影响力的病毒，其感染宿主细胞的过程高度依赖于特定的细胞受体。猪氨基肽酶（PorcineAminopeptidaseN，pAPN）作为冠状病毒的重要细胞感染受体之一，在冠状病毒的感染机制研究中占据着举足轻重的地位。

同属于I群冠状病毒的猪传染性胃肠炎病毒（TransmissibleGastroenteritisVirus，TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）、人冠状病毒229E（HumanCoronavirus229E，HCoV-229E）、猫冠状病毒（FelineCoronavirus，FeCoV）等，都以相应的氨基肽酶作为其细胞感染的受体。这一发现不仅揭示了pAPN在冠状病毒感染过程中的关键作用，也为深入研究冠状病毒的感染机制提供了重要的切入点。以TGEV为例，它能够特异性地识别并结合猪肠道上皮细胞表面的pAPN，从而实现病毒的吸附和入侵，进而引发猪传染性胃肠炎，给养猪业带来严重的经济损失。对于PEDV而言，pAPN同样是其感染宿主细胞的关键受体，PEDV与pAPN的相互作用是病毒感染猪肠道细胞并导致猪流行性腹泻的重要起始步骤。

MDCK（Madin-DarbyCanineKidney）细胞系作为一种广泛应用于病毒学研究的细胞模型，具有诸多独特的优势。它具有良好的传代稳定性，能够在体外进行长期的培养和传代，为病毒的增殖和研究提供了稳定的细胞来源。MDCK细胞对多种病毒具有高度的敏感性，能够支持多种病毒的生长和繁殖，这使得它成为研究病毒感染机制和病毒-细胞相互作用的理想细胞系。在流感病毒的研究中，MDCK细胞被广泛用于流感病毒的分离、培养和鉴定，其对流感病毒的高敏感性使得能够高效地获取大量的病毒样本，为流感病毒的研究提供了有力的支持。此外，MDCK细胞还具有易于操作和培养条件相对简单的特点，这使得它在病毒学研究中得到了广泛的应用。

在MDCK细胞中表达与鉴定猪氨基肽酶，对于深入研究冠状病毒的感染机制具有重要的科学意义。通过在MDCK细胞中成功表达pAPN，并对其进行鉴定，可以进一步明确pAPN在冠状病毒感染过程中的具体作用机制。可以研究pAPN与冠状病毒表面蛋白的相互作用方式，以及这种相互作用如何触发病毒的入侵和感染过程。这对于揭示冠状病毒的感染机制，从分子层面理解病毒的致病过程具有重要的推动作用。在疫苗研发方面，明确pAPN作为冠状病毒受体的作用机制，有助于开发更加有效的冠状病毒疫苗。通过针对pAPN与病毒的相互作用靶点，设计新型的疫苗策略，有望提高疫苗的免疫效果和针对性，为预防和控制冠状病毒感染提供更加有力的手段。在抗病毒药物研发领域，pAPN也为药物研发提供了重要的靶点。通过研究pAPN的结构和功能，开发能够阻断pAPN与病毒相互作用的药物，有望为冠状病毒感染的治疗提供新的方法和途径。

1.2猪氨基肽酶与MDCK细胞研究现状

猪氨基肽酶属于Ⅱ型锌金属蛋白酶，其编码的蛋白包含963个氨基酸。在结构上，pAPN可被胰蛋白酶切成两个片段，分别为95kDa的N端和50kDa的C端。对pAPN外膜结构域的深入分析揭示了其具有四个独立折叠的结构域，即结构域Ⅰ到结构域Ⅳ，这些结构域在不同脊椎动物中呈现出高度的保守性。不同冠状病毒与pAPN的结合位点存在差异，人冠状病毒（HCoV-229E）的S1蛋白通过结构域Ⅱ与pAPN结合，而TGEV的S1蛋白则与结构域Ⅳ结合。这种结合位点的特异性差异，不仅决定了不同冠状病毒的宿主范围和组织嗜性，也为研究冠状病毒的感染特异性提供了重要线索。对于猪δ冠状病毒（PDCoV），其与pAPN的结合依赖于催化结构域Ⅱ，这一发现进一步丰富了我们对冠状病毒与pAPN相互作用多样性的认识。在功能方面，pAPN在细胞代谢和生理过程中发挥着不可或缺的作用。它参与了蛋白质代谢过程，能够催化氨基酸和肽键的水解，从而调节细胞内蛋白质的合成和降解平衡。pAPN还在细胞分裂过程中发挥着重要作用，它可能通过参与细胞信号传导通路，影响细胞的增殖和分化。

MDCK细胞系于1958年由Madin和Darby从健康的雄性可卡猎