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双探针实时PCR：结核杆菌利福平耐药基因突变快速检测新策略

一、引言

1.1研究背景

结核病作为一种古老且严重的全球性公共卫生问题，至今仍对人类健康构成巨大威胁。世界卫生组织（WHO）发布的全球结核病报告显示，尽管近年来全球在结核病防治方面取得了一定进展，但结核病的发病率和死亡率仍然居高不下。2023年，全球仍有近1060万新发病例，110万人死于结核病，每天约有3500人因结核病失去生命。在我国，结核病同样是重点防控的传染病之一，虽然全国结核病疫情呈稳步下降趋势，发病率下降速度是全球平均水平的2倍，成功治疗率保持在90%以上，死亡率维持在较低水平，但由于人口基数庞大，每年新发病例数依然较多，结核病的防治工作依然任重道远。

利福平（Rifampicin，RFP）是抗结核治疗方案中的核心药物之一，属于利福霉素类半合成广谱抗菌药。它通过与结核杆菌菌体RNA聚合酶的β亚基有效结合，抑制聚合酶的活性，从而阻碍细菌DNA转录合成RNA，达到抑制结核杆菌生长繁殖的目的。在标准的抗结核治疗方案中，利福平通常与异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇等药物联合使用，是实现结核病短程化疗的关键药物，对提高结核病的治愈率、降低复发率发挥着不可或缺的作用。

然而，随着抗结核药物的广泛使用，结核杆菌对利福平的耐药问题日益严重。当结核杆菌对利福平产生耐药时，意味着传统的以利福平为核心的抗结核治疗方案疗效会大打折扣，甚至完全失效。这不仅会导致患者的治疗周期大幅延长，从原本的6-9个月可能延长至18-24个月，甚至更久；治疗成本也会显著增加，耐药结核病患者的诊疗费用约为普通结核病患者的数倍，给患者家庭和社会带来沉重的经济负担。更为严峻的是，耐药菌株的传播会使更多人感染耐药结核杆菌，进一步加剧结核病的防控难度，导致疫情反弹，严重威胁公共卫生安全。据统计，2023年我国耐多药/利福平耐药结核病（MDR/RR-TB）患者达2.9万例，占全球的7.3%，位居全球第4位。耐药结核病已成为全球结核病防治工作中的重点和难点问题，迫切需要寻找有效的方法来快速、准确地检测结核杆菌利福平耐药基因突变，为临床治疗提供及时、可靠的指导。

1.2研究目的与意义

本研究旨在建立一种基于双探针实时PCR技术快速检测结核杆菌利福平耐药基因突变的方法，通过对临床样本的检测分析，评估该方法的准确性、灵敏度和特异性，为临床快速诊断结核杆菌利福平耐药提供一种新的技术手段。

快速准确地检测结核杆菌利福平耐药基因突变具有极其重要的意义。在临床治疗方面，能够帮助医生及时了解患者感染的结核杆菌是否对利福平耐药，从而避免盲目使用含利福平的治疗方案，减少无效治疗，提高治疗效果，缩短治疗周期，降低患者的痛苦和经济负担。在公共卫生防控层面，有助于及时发现耐药结核杆菌的传播，采取有效的防控措施，如隔离传染源、加强密切接触者的筛查和管理等，防止耐药菌株的进一步扩散，保护公众健康，对于遏制结核病疫情的蔓延具有关键作用。此外，该技术的建立还可以为结核病耐药机制的研究提供有力的技术支持，推动结核病防治领域的科学研究和技术创新。

1.3国内外研究现状

在结核杆菌利福平耐药基因突变检测方面，国内外学者进行了大量的研究。传统的检测方法主要依赖于直接或间接含药培养进行结核分支杆菌利福平耐药性鉴定，这是体外结核杆菌耐药性的直接证据，并且能够了解其对利福平耐药程度。但由于结核分支杆菌生长缓慢，使得耐药培养耗时长，通常需8-12周，远远不能满足现代短程化疗需要。尽管后来发展起来的应用BACTEC460TB系统进行结核杆菌快速培养及药敏测定能够缩短结果回报时间，但仍需数天，且仪器试剂昂贵，有放射性污染等，限制了临床广泛应用。

随着分子生物学技术的飞速发展，各种新的检测方法应运而生。直接测序法可以准确判定突变的有无及突变性质，是鉴定突变的金标准，通过放射性同位素或荧光标记测序法，已发现许多突变位点及不同的氨基酸置换，突变主要集中在511-533区域内，其中531、526、533、516四个位点最为常见。然而，该方法仪器试剂昂贵，操作复杂，成本高，有放射性污染，不适于大规模推广应用。多聚酶链式反应-单链构象多态性分析法（PCR-SSCP）依据在非变性聚丙烯酰胺凝胶中相同长度单链DNA片段泳动距离的改变来判定单个碱基变异，能同时进行大量临床标本筛选，使结果回报时间缩至48-72小时。但该方法每次电泳均需有标准结核杆菌株对照，有时结果不易区分，且不能辨别沉默突变。DNA芯片技术虽然可以一次对大量位点进行检测，但芯片制备比较复杂，成本较高，影响其临床应用。

双探针实时PCR技术结合了MGB探针的特异和实时PCR快